Seance 9

Question 1

Qu’est-ce que la réaction de polymérisation en chaîne?

Answer 1

une méthode enzymatique simple et rapide qui permet, in vitro, l’amplification de manière exponentielle d’un fragment spécifique d’ADN, que ce soit une portion de chromosome, un génome viral ou un gène…

Question 2

Qu’est-ce que le PCR?

Answer 2

Sur le fonctionnement cyclique d’une ADN-polymérase capable de copier, en une séquence complémentaire, un fragment simple brin d’ADN matrice. Le processus d’élongation s’effectue par l’addition successive des dNTP complémentaires, à partir de l’extrémité 3’OH d’une amorce de polynucléotides spécifiques préalablement hybridée à l’ADN matrice. Par contre, l’incorporation de ddNTP au lieu de dNTP, telle la didéoxyadénine (ddA) dans la nouvelle chaîne synthétisée, entraîne l’arrêt de l’élongation puisque l’extrémité 3’OH des ddNTP ne se lie à aucun dNTP.

(**il y a une plus grande concentration de dNTP que de ddNTP, c’est ce qui permet leur attachement de façon variable à différent endroit permettant l’arrêt à différentes longueurs)

Question 3

En quelle année et par qui a été introduit la technique du PCR?

Answer 3

1986 par K. Mullis

Question 4

Quelles sont les étapes de la technique PCR?

Answer 4

1) dénaturation à haute température (92C) du fragment d’ADN double brin à amplifier
2) hybridation sur chaque brin des amorces spécifiques: deux oligonucléotides complémentaires d’une courte séquence située aux extrémités 3’OH des brins de la matrice encandrant la région d’intérêt.
3) élongation des amorces par une ADN-polymérase en des séquences complémentaires.

Question 5

Quels sont les éléments qui doivent être mis en contact dans un thermocycleur afin d’amplifier le fragment d’ADN?

Answer 5

1) deux amorces de polynucléotides spécifiques
2) une ADN polymérase
3) un mélange de déoxynucléotides (dNTP) dans un tampon
4) une concentration critique de MgCl₂ dans le tampon

Question 6

Lequel des deux éléments suivant, les amorces vs les fragments d’ADN à amplifier, est ajouté en large excès comparativement à l’autre pour l’amplification par PCR?

Answer 6

les amorces (oligonucléotides de 20-30 nucléotides)

Question 7

Que permet l’incorporation de séquences non complémentaires à l’ADN matrice à l’extrémités 5’ des amorces?

Answer 7

Permet d’introduire des sites de restriction ou des sites de régulation dans les ADN produits.

Question 8

Quelle ADN polymérase était initialement utilisé pour l’élongation des amorces?

Answer 8

L’ADN polymérase I d’Écherichia coli, ou fragment de Klenow.

Question 9

Pourquoi l’ADN polymérase I d’Escherichia coli fut-elle remplacé?

Answer 9

À cause des températures élevées nécessaires aux différentes étapes de synthèse in vitro, un apport constant d’ADN polymérase était rendu néssaire entre chaque cycle.

Question 10

Quelle ADN polymérase remplaça l’ADN pol I d’Escherichia coli?

Answer 10

Une ADN pol thermostable isolée chez Thermophilus aquaticus, la Taq polymérase.

Question 11

Qu’est-ce que la Taq pol a permi en comparaison à l’ADN pol I d’E. coli?

Answer 11

Le développement de processeurs automatique de PCR ou thermocycleurs.

Question 12

Quelles sont les trois étapes du programme cyclique des thermocycleurs?

Answer 12

1) 94C pendant 20 secondes pour la dénaturation des matrices
2) 55C pendant 30 secondes pour l’hybridation des amorces
3) 72C pendant 30 secondes pour la synthèse in vitro de l’ADN par élongation des amorces respectives.

Question 13

Quel est l’agent intercalant de l’ADN fluoresçant sous UV utilisé pour colorer l’électrophorèse sur gel d’agarose suite à 30 cycles PCR?

Answer 13

le bromure d’éthidium

Question 14

Quels sont les applications possibles de la méthode PCR de base?

Answer 14

1) le clonage et le sous-clonage
2) Séquençage
3) Mutagenèse dirigée
4) Détection, identification et quantification

Question 15

Quelles sont les 3 étapes PCR en un mot chacun?

Answer 15

1) Dénaturation
2) Hybridation
3) Polymérisation

Question 16

Qu’est-ce qui détermine la spécificité de l’hybridation des amorces?

Answer 16

1) la température durant l’hybridation
2) la concentration de Mg dans le tampon.

Question 17

La réaction PCR est fait de manière:

a) exponentielle
b) logarythmique
c) linéaire

Answer 17

a) exponentielle 2ⁿ

Question 18

Qu’est-ce que le PCR quantitatif?

Answer 18

Appareil PCR qui fait la lecture en continu de la fluorescence, donc de la quantité d’ADN produit dans la réaction en fonction du nombre de cycle

Question 19

La Taq polymérase a quelle propriété intéressante?

Answer 19

Elle est thermosensible

Question 20

Qu’est-ce que la qRT?

Answer 20

quantitative Reverse Transcriptase PCR

Question 21

Qu’est-ce que la méthode de Sanger?

Answer 21

Une méthode de séquençage classique par PCR où une certaine quantité de didéonucléotides radioactifs d’une des quatres base, sont ajoutés avec les nucléotides réguliers afin que la polymérisation soit arrêtée lorsque les ddnucléotides de cette base sont ajoutés à la chaine.
Les ddNTP s’ajoute de façon aléatoire créant ainsi toutes les possibilités de longueurs de chaînes. Les brins d’ADN amplifiés sont passés dans un gel d’électrophorèse et révélé par autoradiographie afin de déterminer à quel endroit sur la chaine cette base est situé
La même chose est ensuite fait pour les 3 autres bases, puis il est alors possible de recréer l’ordre génique des bases.

Question 22

Comment peut-on faire de la mutagénèse dirigé par PCR, méthode complexe?

Answer 22

1. Introduit une amorce avec une mutation à un endroit précis du brin à muté, cette amorce sert à produire un premier fragment d’ADN.
2. Le fragment d’ADN contenant la mutation servira sert d’abord de matrice pour une deuxième amorce, qui va polymériser un brin complémentaire contenant la mutation voulu.
3. Ce fragment complémentaire servira à son tour d’amorce sur un brin original non muté, et le brin muté sera polymérisé en entier
4. Ce brin entier muté servira alors de matrice pour une troisième amorce afin de synthétiser le brin complémentaire avec la mutation.
5. Un criblage doit être fait afin de sélectionné le virus muté recherché.

Question 23

Comment peut-on faire de la mutagénèse dirigé par PCR, méthode simple?

Answer 23

1. Utilisation de plasmides circulaires.
2. Deux amorces mutés sont utilisées plutôt qu’une seule.
3. Une enzymes digestive, DpnI est utilisé pour digéré les plasmides méthylés, puisque ceux-ci seraient les originaux créé in vivo, ceux créé par PCR in vitro n’étant pas méthylé, donc non digéré.

Question 24

Comment est fait le séquençage aujourd’hui selon la méthode de Sanger?

Answer 24

1) Les didéonucléotides sont fluorescent plutôt que radioactifs.
2) Les quatre ddNTP bases sont ajoutés en même temps et fluorescent à des couleurs différentes
3) L’électrophorèse capillaire avec détection par fluorescence est utilisé afin de déterminer dans quel ordre chaque base est situé grâce à l’élution des plus petites molécules vers les plus grosses.