SAU 1 OPGAVER CELLE

Question 1

Forklar hvorfor man tilsætter SDS til prøverne

Answer 1

SDS tilsættes for at denaturere proteinet (bryder non-kovalente bindinger) og for at tilføre proteinet en overordnet negativ ladning, således at længden af polypeptidkæden bliver bestemmende for, hvor langt polypeptidet migrerer inden for en given tidsenhed.

Question 2

Et oprenset membranprotein bliver undersøgt ved hjælp af SDS polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). Det ønskes afgjort hvor mange subunits proteinet består af. Proteinets samlede molekylvægt er 80 kDa, og alle subunits er transmembrane.

Det oprensede protein fordeles først ud i 3 rør, og der tilsættes:

Prøve 1: SDS

Prøve 2: SDS + DTT (et reducerende stof, der bryder svovlbroer)

Prøve 3: SDS + DTT + glykosidase (et enzym, der kløver alle sukkergrupper af proteinet)

På bane 4 sættes størrelsesmarkører.

Skitser ud fra resultatet af SDS-PAGEn (figur 1) en mulig
kvarternær struktur af proteinet (hver subunit illustreres som en oval struktur i en membran med angivelse af den ekstracellulære side samt størrelsen af hver subunit).

Answer 2

Molekylvægtene er cirka-værdier. De tre subunits kan også sidde i andre rækkefølger, dette er kun et eksempel. S-S broer og glykosyleringer sidder på den ekstracellulære side af cellemembranen (se forklaring under spørgsmål 5).

Question 3

Definer ’post-translationelle modifikationer’.

Answer 3

Kovalente modifikationer, der påføres proteinet efter translationen.

Question 4

Placer ud fra resultatet på SDS-PAGEn de relevante post-
translationelle modifikationer på proteinet

Answer 4

Molekylvægtene er cirka-værdier. De tre subunits kan også sidde i andre rækkefølger, dette er kun et eksempel. S-S broer og glykosyleringer sidder på den ekstracellulære side af cellemembranen (se forklaring under spørgsmål 5).

Question 5

Angiv på hvilke aminosyrer disse posttranslationelle modifikationer generelt kan findes

Answer 5

S-S broer sidder primært på ekstracellulærsiden (delvist fordi cytosolen er reducerende, og delvist fordi de dannes i lumen af ER) og dannes af to cysteiner. N-type glykosylering findes ekstracellulært (da de påsættes i lumen af ER og golgi apparatet) på asparagin. (O-glykosylering forventes ikke nævnt, men kan finde sted på serine og threonin – og i mindre grad tyrosin. En af disse, O-GlcNAc , sågar også intracellulært.)

Question 6

Definer begrebet ’subunit’.

Answer 6

En subunit udgøres af en individuel polypeptidkæde i et multimerisk protein.

Question 7

Angiv hvilket strukturniveau ’subunits’ tilhører (primær, sekundær, tertiær, kvaternær).

Answer 7

Vi definerer subunits som værende en polypetidkæde i et multimert protein. Dvs. at svaret er kvaternær struktur. (Nogle steder vil man se, at subunits fejlagtigt bliver brugt til at beskrive et protein bestående af en enkelt polypeptidkæde.)

Question 8

Angiv antal subunits i ovenstående antistof.

Answer 8

Fire subunits.

Question 9

Definer begrebet ’domæne’.

Answer 9

Et domæne er defineret som: ”et segment af en polypeptid kæde, der uafhængigt kan folde til en kompakt stabil struktur”. Ofte er et domæne associeret med en specifik funktion.

Question 10

Sæt ring omkring domænerne i antistoffet i figuren og angiv antal.

Answer 10

12 domæner. (Antigenbindingssitet defineres ikke som et domæne, da det udgøres af to forskellige polypeptidkæder.)

Question 11

For at undersøge om det oprensede protein er fosforyleret og i givet fald på hvilken subunit, benyttes dette antistof nu til at lave et western Blot på SDS-PAGEn fra figur 1 (spørgsmål 1)

Skitser ud fra resultatet på western blottet på figur 3,
hvorvidt (og i givet fald hvor) proteinet er fosforyleret. Brug
evt. figur 4 bagerst i materialet til at sammenholde SDS-
PAGE og western blot

Answer 11

Molekylvægtene er cirka-værdier. De tre subunits kan også sidde i andre rækkefølger, dette er kun et eksempel. S-S broer og glykosyleringer sidder på den ekstracellulære side af cellemembranen (se forklaring under spørgsmål 5).Den lille subunit (15 kDa) er fosforyleret -altid på den cytosoliske side.

Question 12

Angiv hvorledes fosfatgruppen påføres proteinet.

Answer 12

γ-fosfatgruppen fra ATP overføres til aminosyren ved hjælp af en kinase.

Question 13

Angiv hvilken ladning proteinet påføres ved fosforylering.

Answer 13

Proteinet påføres negativ ladning ved fosforylering.

Question 14

Sæt ring om de aminosyrer der kan fosforyleres.

Answer 14

(I sjældne tilfælde kan andre aminosyrer fosforyleres. Dette er ikke noget, vi fokuserer på, men i figur 12-13 i ECB vises en asparaginsyre fosforyleret.)

Question 15

Efter nogle yderligere biokemiske analyser opdager forskeren, at membranproteinet interagerer med et cytoplasmisk protein. Denne interaktion observeres udelukkende når C-terminus i det ovenstående membranprotein er fosforyleret. Han ændrer nu den aminosyre der bliver fosforyleret til en række forskellige aminosyrer og undersøger, om han genfinder interaktionen med det cytoplasmiske protein i disse versioner af membranproteinet.

Redegør for det opståede mønster ud fra tabellen

Answer 15

Mutationer til asparaginsyre og glutaminsyre vil mimikere den negative ladning, som fosfatgruppen ellers bidrager med og kan dermed indgå i interaktionen med det cytoplasmatiske protein.

Question 16

Angiv hvilken intermolekylær kraft, der binder de to proteiner sammen.

Answer 16

Ionbindinger (saltbroer) binder disse to fragmenter sammen.

Question 17

Angiv andre mulige intermolekylære kræfter.

Answer 17

Hydrogenbindinger, van der Waals interaktioner (herunder London interaktioner) og hydrofobe interaktioner

Question 18

For at bestemme hvilket område af det cytosoliske protein, der interagerer med det fosforylerede membranprotein, syntetiserer forskeren derefter nogle peptidfragmenter fra det cytosoliske protein:
A: Ser-Pro-Asn-Ile-Phe

B: Ala-Glu-Tyr-Asp-Leu

C: Cys-Asn-His-Phe-His
D: Met-Val-Gln-Trp-Gly

E: Gly-Lys-Pro-Arg-Ile
Ét af disse fragmenter binder til den fosforylerede del af membranproteinet ved pH 7.4.

Redegør for hvilket af disse fragmenter, du forventer, vil binde.

Answer 18

Ved pH 7.4 er E fragmentet positivt ladet (arginin og lysin) og kan dermed interagere med det fosforylerede protein. I mindre grad C, da histidin har et pKa på 6.

Question 19

Ved pH 5.0 er der yderligere ét fragment, der binder til den fosforylerede del af membranproteinet.

Redegør for hvilket yderligere fragment, der binder ved denne pH. (hint; pKa)

Answer 19

Ved pH 5.0 forventes en stor fraktion af histidinerne at være protoneret, og vil dermed nu også have den netto-positive ladning, der vil fremkalde en interaktion med membranproteinet. C kan dermed også binde.

Question 20

Det viser sig, at det cytosoliske protein er et enzym, og at den enzymatiske aktivitet udelukkende fungerer efter binding af enzymet til den fosforylerede del af membranproteinet.

Angiv betegnelsen for denne type modulering.

Answer 20

Allosterisk regulering. Når det cytosoliske protein binder til det transmembrane protein, vil det (formentligt) ændre konformation og dermed øge sin katalytiske aktivitet og eller ”åbne op for” et substratbindingssite.

Question 21

Forskeren opdager, at enzymets funktion hæmmes, efter det har været aktivt et stykke tid. Redegør for hvilke typer hæmning, der kan finde sted.

Answer 21

I) Det frie produkt kan kompetitivt hæmme det aktive site eller II) produktet binder andet sted end det aktive site og hæmmer enzymet allosterisk (nonkompetitivt). Der kan sikkert sagtens findes på alternative forklaringer til et sådant fænomen, men disse to er aktuelle i denne kontekst.