Regulation der Genexpression TF

Question 1

Was sind die Kernaussagen der VL?

Answer 1

◼ Transkriptionsfaktoren haben einen modularen Aufbau mit verschiedenen Domänen für DNA-Bindung, Aktivierung, Dimerisierung und Regulation
◼ Es gibt drei wichtige DNA-DBD-Motive (basic leucin zipper, helix-turn-helix und Zn2+-Finger)
◼ Rekombinante Zn2+-Finger-Proteine können zur Genkorrektur verwendet werden
◼ TF können Homo- und Heterodimere bilden
◼ TF werden durch Effektormoleküle über Phosphorylierung, Methylierung, Acethylierung, Redox-Regulation reguliert, was ihre DNA-Bindung, Translokation in den Nukleus und Transaktivierung beeinflusst

Question 2

Was sind Sequenzspezfische DNA-Bindeproteine? (STF)

Answer 2

◼ Typische modulare Struktur mit unterschiedlichen Domänen
◼ Bindung an die cis-Elemente
❑ Registrierung von Signalen
❑ Übermittlung von Signalen an die RNA Pol, den Mediator- Komplex und das Chromatin
❑ Mehr als 2000 werden durch das humane Genom kodiert
◼ Transkriptions-Aktivatoren/-Repressoren
❑ abhängig von Chromatin assoziierten Proteinen

Question 3

Von N Richtung C Terminus, wie sind STF’s aufgebaut?

Answer 3

N&raquo_space; DNA Bindung&raquo_space; Dimerisierung&raquo_space; Aktivierung&raquo_space; Regulation&raquo_space; C

Question 4

Was sind DNA-Bindungsdomänen?

Answer 4

◼ Oft separate Struktureinheit im Protein
◼ Falten sich unabhängig von anderen Domänen des Proteins
◼ Stabilisiert durch andere Elemente des Proteins (kurze a-Helix und b-Faltblattstrukturen)
◼ Bindung hauptsächlich an die große Furche der DNA
◼ a-Helix passt gut in diese Furche, deshalb hierüber die Interaktion mit der DNA

Question 5

Was sind Strukturen von DNA binding Protein Domains (DBD)

Answer 5

• Helix-turn-Helix
• Zinkfinger
• Leucin Zipper

Question 6

Was sind Helix-turn-Helix Motive?

Answer 6

◼ Zwei a-Helices, die über einen kurzen b-Faltblattstiel aus Aminosäuren verbunden sind
◼ Bindungssequenzen in der DNA sind Palindrome,
❑ d.h. sie sind aus zwei invertierten, spiegelbildlich angeordneten Sequenzen in zwei aufeinanderfolgenden großen Furchen der DNA
◼ Erkennungshelix: Bindung an die große Furche der DNA
❑ Wechselwirkung über Wasserstoff-Brücken, Ionenbindung, hydrophobe Wechselwirkung
❑ Stabilisierung der DNA und Erhöhung der Spezifität
◼ Dimerisierungshelix:
❑ Stabilisierung der Bindung an die DNA

> > Passgenaue Bindung in zwei aufeinanderfolgenden großen Furchen

Question 7

Was ist das Zink-Finger Motive (I)?

Answer 7

◼ Zn2+-Finger 30 Aminosäuren lange Proteindomäne
◼ Meist Bestandteil von Transkriptionsfaktoren und Steroidhormonrezeptoren (z.B. Glucocorticoidrezeptor)
◼ Zn2+ als Zentralatom mit vier Liganden verbunden
❑ Möglichkeiten zinc-Cys2-His2, zinc- Cys4, zinc2-Cys6

Question 8

Was ist das Zink-Finger Motive (II)?

Answer 8

◼ Dimerisierung der Zinc-Finger enthaltenden Proteine und Bindung der a-Helix in der großen Furche der DNA
◼ Zn2+ -Bindungselement sorgt für Ausrichtung der Erkennungshelix, bindet selbst nicht an die DNA
◼ In Abwesenheit von Zn2+-Ionen oder Liganden (Veränderung in der Struktur) zerfällt der dimerische Komplex und löst sich von der DNA)

Question 9

Was ist as Zink-Finger Motive (III)?

Answer 9

◼ Zn2+-Finger können nahezu spezifisch an jede DNA Sequenz binden
◼ 3 Aminosäuren (Position -1, 3 und 6 in der Helix) interagieren mit jeweils 3 Nukleotiden auf dem kodierenden Strang der DNA und die Aminosäure an Position 2 mit dem Komplementärstrang über hydrophobe Interaktionen

Question 10

Was ist ein Beispiel eines Zink-Finger Proteins?

Answer 10

Aktivierung des Glucocorticoidrezeptors

◼ Inaktive Form: Glucocorticoidrezeptor liegt im Cytosol gebunden an hsp90 und p59 vor
◼ Aktive Form: Bindung von Cortisol an den Zn2+ - Finger Rezeptor
◼ Dissoziation des inaktivierten Proteinkomplexes
◼ Wanderung des ligandengebundenen Rezeptors in den Zellkern
◼ Bindung an Enhancersequenzen und Aktivierung der Genexpression (Enzyme der Gluconeogenese)

Question 11

Wie werden rekombinante Zink-Finger Proteine hergestellt und was ist der Vorteil?

Answer 11

◼ Durch Fusion einzelner Zn2+ -Finger Motive hergestellt
◼ 18 nt auf der DNA werden erkannt
◼ Spezifität erhöht sich
◼ Unterschiedliche Zn2+-Finger Motive erkennen unterschiedliche Tripletcode auf der DNA
◼ „Mischen“ unterschiedlicher Zn2+ -Finger Motive ermöglicht die Herstellung von rekombinanten Proteinen die hochspezifisch eine spezifische DNA Sequenz erkennen können.
Anwendung:
◼ Genkorrektur (echte Gentherapie)
◼ Erbliche monogene Erkrankungen mit defekten Genen

Question 12

Was sind Mechanismen von Zink-Finger-Endonukleasen? (I)

Answer 12

◼ ZFN-Paar wird in eine Zelle verbracht
❑ (Transfektion, Electroporation, viraler Vektor)
◼ ZFN-Paar erzeugt Doppelstrang-Bruch
◼ Co-Transfektion mit einem Reparatur-Template

Question 13

Was sind Mechanismen von Zink-Finger-Endonukleasen? (II)

Answer 13

◼ Homologe Reparatur
❑ Rekombination durch überlappende Sequenzen
❑ Zwischen der genomischen DNA und eingebrachten homologen Sequenzen
◼ Nicht-homologe Reparatur
❑ Reparatur durch zelleigene Proteine
❑ Zufällige Fehler entstehen (Deletionen/Insertionen)
◼ Nicht –homologe Reparatur Insertion
❑ Reparatur durch zelleigene Proteine
❑ Fremdsequenzen werden inseriert

Question 14

Was ist das Ziel der Zink Endonuklease als HIV-Therapie?

Answer 14

Ausschalten des HIV Co-Rezeptors CCR5 in CD4+ T-Zellen

Question 15

Was ist das Basic Leucin-Zipper Movie?

Answer 15

◼ Name durch regelmäßiges Vorkommen von Leucine alle 7 AS in d. a-Helix
◼ Durch sequentielle Anordnung sind alle hydrophoben Leucine an einer Seite der a- Helix angeordnet (hydrophobic core); Links- gängige Superhelix (engl. Coiled-Coil)
◼ hydrophobe Interaktion führt zu reißverschlussartiger (engl.: Zipper) Zusammenlagerung
◼ Leucin-Zipper selbst bindet nicht an DNA sondern dient nur zur Interaktions-Vermittlung zur Dimerisierung

Question 16

Was ist das Helix-loop-Helix (HLH) Motive?

Answer 16

◼ Helix-Loop-Helix-Motiv
❑ Proteindomäne besteht aus zwei a-Helices + Schleife
❑ Hetero- oder Homodimerisierung mit Partner
◼ Bündel aus 4 Helices mit zwei basisches Enden entsteht
❑ Längere a-Helices ausgehend vom Dimerisierungsbereich stellen spezifische DNA-Kontakte her
❑ Beispiel MyoD (Transkriptionsfaktor, wichtig für die Muskeldifferenzierung)
◼ DNA-Bindung über β-Faltblattstruktur
❑ Beispiel: Eukaryontischer Transkriptionsfaktor NFκB

Question 17

Was sind molekulare Interaktionen zwischen DNA-bindenen Proteinen und der DNA?

Answer 17

◼ H-Brückenbindungen
❑ zwischen Aminosäuren der Proteine und den Nukleotiden der DNA
◼ Metallionen
❑ Beispiel: Bindung des Transtriptionsaktivators ACE an die DNA erfolgt durch Einlagerung von 8 Kupfer-Ionen in das Protein
◼ Van der Vaal Bindungen
❑ Zwischen Zuckerresten der DNA und hydophober Oberfläche der Proteine
❑ Beispiel Bindung TBP mit der TATA Box

Question 18

Können TF Homo- und Heterodimerisch sein?

Answer 18

Ja

Question 19

Was sind die Untergruppen von Homo- und Heterodimerischen TF?

Answer 19

Dimerisierung:
❑ über Helix-Loop-Helix Motive
❑ Leucin Zipper
❑ Heterodimer (unterschiedliches Protein)
❑ Homodimer (gleiches Protein)
❑ Heterodimerisierung erhöht die
Gewebsspezifität der Transkription

Fos-Familie:
❑ keine Homodimere, müssen mit den TF der jun-Familie heterodimerisieren
❑ Jun-Jun, Jun-Fos binden präferentiell an TGACTCA
❑ Jun-ATF, ATF-Homodimere binden präferentiell an TGACGTCA

Question 20

Welche Struktur haben DNA-erkennende Sequenzen von DNA Binding Proteins?

Answer 20

◼ 3-8 bp lang
◼ Struktur-Symmetrie
❑ Inverted repeat (Palindrom)
❑ Direkte Wiederholungen
◼ Typisch: Transkriptionsfaktoren binden als Dimer
◼ Bindung von heterodimerischen und homodimerischen Proteinen ist möglich

Question 21

Was macht die (Trans)Aktivierungsdomäne aus?

Answer 21

❑ Essentiell für die Aktivierung
◼ Interagieren mit unterschiedlichen Proteinen und kooperieren bei der Transkription
◼ Können eine oder mehrere Transaktivierungsdomänen haben
◼ Keine generellen Strukturmotive:
❑ Glutamin-reiche Motive
❑ Proline-reiche Regionen
❑ hydrophobe b-Faltblattstruktur

Question 22

Wie kann man Aktivierungsdomänen detektieren?

Answer 22

Fusionsproteine

Question 23

Wie werden TF reguliert?

Answer 23

◼ Veränderungen in der Konzentration von regulatorischen DNA- Bindungsproteinen
◼ Regulation durch Bindung von Effektormolekülen
❑ Calcium
❑ Hormone
❑ Inhibitorische Proteinkomplexe
◼ Post-translationale Modifikation von Transkriptionsregulatoren
◼ Regulation durch Phosphorylierung
❑ Regulation der nukleären Lokalisation durch Phosphorylierung
❑ Phosphorylierung von DBD
❑ Phosphorylierung der AD
◼ Regulation durch Methylierung, Acetylierung und Redox-Modifikation
◼ Signal Transduction Networks
❑ Constitutiv aktive, regulatorische, entwicklungsabhängige TF
❑ Signal-abhängige TF
◼ Repression der Transkription

Question 24

Was sind die Mechanismen der Regulierung der Aktivität von DNA binding Proteins?

Answer 24

◼ Bedeutender Mechanismus
Signale führen zum Transfer des Proteins vom Zytoplasma in den Zellkern
◼ Können in aktiver und inaktiver Form vorliegen
◼ Signale im Zytoplasma oder Nukleus führen zur Transition
◼ Daneben bestimmen die Aktivität
❑ Interaktionen mit dem Transkriptionsapparat
❑ Expressionsrate und Degradationsrate

Question 25

Was sind die 3 Hauptwege zur Veränderung der Konzentartion von DNA-binding Proteinen?

Answer 25

❑ De novo Synthese
◼ Wichtig bei der Entwicklung und Differenzierung von Organismen
❑ Degradation (Proteolyse via Ub-Proteasome pathway)
❑ Subzelluläre Lokalisation
◼ Insbesondere Zytoplasma ↔ Nukleus

Question 26

Was ist ein Beispiel für die Regulierung von TF durch Bindung von Effektormolekühlen? (I)

Answer 26

◼ Ca2+ - Ionen
❑ Schlüssel Effektor-Molekül in Eukaryonten
❑ Bindung an intrazelluläre Signalproteine

Question 27

Was aktiviert und deaktiviert Ca2+?

Answer 27

Aktivierung: NFAT (nuclear-Factor of activated T-cells), allgemeiner TF vor allem in Immunzellen

Inaktivierung: DREAM (Transkriptionsrepressor, einziger TF der Ca2+ direkt bindet ohne DREAM keine Schmerzen)

Question 28

wie können TF durch Bindung der Effektormoleküle Hormone reguliert werden?

Answer 28

❑ Zellkern-Rezeptoren
❑ Aktivierung durch Bindung von Liganden
◼ Aufhebung der Repression des Rezeptors durch Translokation in den Zellkern
❑ besonders Steroidhormone

Question 29

Welche Hormone gehören zu den Steroidhormonen?

Answer 29

• Cortisol
• Aldosterone
• Progesterone
• Testosterone
• Vitamin D3(?)

Question 30

Wie sieht der Steroidhormon-Pathway aus?

Answer 30

◼ Sterodidhormone werden durch Liganden aktiviert
❑ (Östrogen, Testosteron, Cortisol) im Zytoplasma
◼ Transfer in den Nukleus
◼ Aktivierung der Transkription
❑ Bindung an die DNA (Zink-finger)
❑ Interaktion mit Jun und Fos-Proteinen

Question 31

wie können TF durch Bindung der Effektormoleküle Inhibitorische Proteinkomplexe reguliert werden?

Answer 31

❑ TF formt Komplex mit inhibitorischem Protein
❑ z.B. NFkB, + IkB = inaktiv
❑ Signal→Phosphorylierung von IkB = Proteolyse und Freisetzung von NFkB = aktiv

Question 32

Welche Post-translationalen Modifikationen von TF gibt es?

Answer 32

❑ Phosphorylierung (Hauptmechanismus)
❑ Methylierung
❑ Acethylierung
❑ Redox-Modifikation
❑ Proteolyse
» Die meisten TF können verschieden
modifiziert werden und haben multiple und
unterschiedliche Modifikationen

Question 33

Welche AS werden phosphoryliert bei der Regulation durch Phosphorylierung, wer ist bei der Regulation mit beteiligt und was wird reguliert?

Answer 33

◼ Phosphorylierung am Ser oder Thr, seltener an Tyr
◼ Beteiligt daran
❑ spezifische Proteinkinasen und Phosphatasen
◼ Reguliert wird
❑ Zellkernlokalisation
❑ DNA-Bindung
❑ Transaktivierung

Question 34

Was wird bei der Regulierung durch Methylation und Acetylation methyliert bzw acetyliert?

Answer 34

❑ z.B. p53 (Zellzykluskontrolle)
❑ Reguliert durch Methylierung und Acetylierung von Arg oder Lys

Question 35

Was ist die zentrale Bedeutung der Redox-Regulation

Answer 35

Reversible Oxidation von Cystein
◼ Unterschiedlicher Oxidationsstaus
❑ Sulfenic acid (-SOH),
❑ Sulfinic acid (-SO2)
❑ Sulfonic acid (-SO3),
❑ Disulfid (Cys-S-S-R)
❑ Nitrosothiol (-SNO)
❑ Reversible Oxidation von Cystein
◼ z.B. AP-1,
❑ enthält Cystein Motive
❑ Regulation durch oxidativen Stress
❑ Bindungsaktivität ist reduziert nach Oxidation

Question 36

Wie werden TF bei bei dem Signal Transduktionsnetzwerk eingeteilt?

Answer 36

Konstitutiv aktive TF
❑ Im Nucleus aller Zellen, zu
jeder Zeit
❑ Keine spezifische Kontrolle
individueller Gene
❑ Housekeeping Gene

Regulatorische TF
❑ Zelltyp-spezifisch
❑ Abhängig von internen
und externen Signalen

Entwicklungs-abhängige TF
❑ Oft ohne post-translationale
Modifikation

Signal-abhängige TF
❑ Aktiv erst nach Aktivierung
durch spezifische Signale

Question 37

Welche Arten von Aktivierung der Transkription durch Aktivatorproteine gibt es?

Answer 37

◼ 1. Aktivierung durch niedrig
molekulare Hormone
❑ Zellkern-Rezeptor Familie (Steroid-Rezeptor Superfamilie)

◼ 2. Aktivierung durch interne Signale
❑ z.B. durch Erhöhung der intrazellulären
Sterol –Konzentration (SREBP)
❑ p53 aktiviert durch DNA-Damage

◼ Aktivierung durch
Oberflächenrezeptor-Ligand-
Interaktion
❑ 3. Resident nuclear factors
◼ Permanent im Zellkern
◼ Aktivierung durch Phosphorylierung
❑ 4. Latent cytoplasmatic factor
◼ Im Zytoplasma
◼ Translokation in den Zerllkern und Aktivierung durch Phosphorylierung
◼ Oft Proteolyse notwendig zur vollen Aktivierung

Question 38

Welche Arten von Inhibitation der Transkription durch Repressor-Proteine gibt es?

Answer 38

◼ Unspezifische Repression
❑ Repression der Chromatinstruktur (1)
◼ Spezifische Repression (an die DNA
Sequenz gebunden)
❑ Inhibiert die Transkriptionsinitiation (2)
❑ Inhibierung durch Bindung an TF (3, 4)
❑ Inhibierung durch Bindung an „Silencer“ Sequenzen (5)
◼ Repressor hat eine Repressor-Domäne (z.B. KRAB)
◼ Weitere Mechanismen:
❑ Heterodimerisierung
❑ Phosphorylierung
❑ Cytosolische Retention
❑ Bindung von Inhibitoren

Question 39

Wovon kann es abhängig sein, ob ein Protein ein Repressor oder Aktivator ist?

Answer 39

❑ der Umgebung
❑ Vorhandensein anderer TF
❑ spezifischen niedermolekularer Substanzen
❑ z.B. Vitamin A-Säure:
◼ minus Ligand: DNA-Bindung und Repression
◼ plus Ligand: DNA-Bindung und Aktivierung