Regulation der Genexpression TF Flashcards
Was sind die Kernaussagen der VL?
◼ Transkriptionsfaktoren haben einen modularen Aufbau mit verschiedenen Domänen für DNA-Bindung, Aktivierung, Dimerisierung und Regulation
◼ Es gibt drei wichtige DNA-DBD-Motive (basic leucin zipper, helix-turn-helix und Zn2+-Finger)
◼ Rekombinante Zn2+-Finger-Proteine können zur Genkorrektur verwendet werden
◼ TF können Homo- und Heterodimere bilden
◼ TF werden durch Effektormoleküle über Phosphorylierung, Methylierung, Acethylierung, Redox-Regulation reguliert, was ihre DNA-Bindung, Translokation in den Nukleus und Transaktivierung beeinflusst
Was sind Sequenzspezfische DNA-Bindeproteine? (STF)
◼ Typische modulare Struktur mit unterschiedlichen Domänen
◼ Bindung an die cis-Elemente
❑ Registrierung von Signalen
❑ Übermittlung von Signalen an die RNA Pol, den Mediator- Komplex und das Chromatin
❑ Mehr als 2000 werden durch das humane Genom kodiert
◼ Transkriptions-Aktivatoren/-Repressoren
❑ abhängig von Chromatin assoziierten Proteinen
Von N Richtung C Terminus, wie sind STF’s aufgebaut?
N»_space; DNA Bindung»_space; Dimerisierung»_space; Aktivierung»_space; Regulation»_space; C
Was sind DNA-Bindungsdomänen?
◼ Oft separate Struktureinheit im Protein
◼ Falten sich unabhängig von anderen Domänen des Proteins
◼ Stabilisiert durch andere Elemente des Proteins (kurze a-Helix und b-Faltblattstrukturen)
◼ Bindung hauptsächlich an die große Furche der DNA
◼ a-Helix passt gut in diese Furche, deshalb hierüber die Interaktion mit der DNA
Was sind Strukturen von DNA binding Protein Domains (DBD)
- Helix-turn-Helix
- Zinkfinger
- Leucin Zipper
Was sind Helix-turn-Helix Motive?
◼ Zwei a-Helices, die über einen kurzen b-Faltblattstiel aus Aminosäuren verbunden sind
◼ Bindungssequenzen in der DNA sind Palindrome,
❑ d.h. sie sind aus zwei invertierten, spiegelbildlich angeordneten Sequenzen in zwei aufeinanderfolgenden großen Furchen der DNA
◼ Erkennungshelix: Bindung an die große Furche der DNA
❑ Wechselwirkung über Wasserstoff-Brücken, Ionenbindung, hydrophobe Wechselwirkung
❑ Stabilisierung der DNA und Erhöhung der Spezifität
◼ Dimerisierungshelix:
❑ Stabilisierung der Bindung an die DNA
> > Passgenaue Bindung in zwei aufeinanderfolgenden großen Furchen
Was ist das Zink-Finger Motive (I)?
◼ Zn2+-Finger 30 Aminosäuren lange Proteindomäne
◼ Meist Bestandteil von Transkriptionsfaktoren und Steroidhormonrezeptoren (z.B. Glucocorticoidrezeptor)
◼ Zn2+ als Zentralatom mit vier Liganden verbunden
❑ Möglichkeiten zinc-Cys2-His2, zinc- Cys4, zinc2-Cys6
Was ist das Zink-Finger Motive (II)?
◼ Dimerisierung der Zinc-Finger enthaltenden Proteine und Bindung der a-Helix in der großen Furche der DNA
◼ Zn2+ -Bindungselement sorgt für Ausrichtung der Erkennungshelix, bindet selbst nicht an die DNA
◼ In Abwesenheit von Zn2+-Ionen oder Liganden (Veränderung in der Struktur) zerfällt der dimerische Komplex und löst sich von der DNA)
Was ist as Zink-Finger Motive (III)?
◼ Zn2+-Finger können nahezu spezifisch an jede DNA Sequenz binden
◼ 3 Aminosäuren (Position -1, 3 und 6 in der Helix) interagieren mit jeweils 3 Nukleotiden auf dem kodierenden Strang der DNA und die Aminosäure an Position 2 mit dem Komplementärstrang über hydrophobe Interaktionen
Was ist ein Beispiel eines Zink-Finger Proteins?
Aktivierung des Glucocorticoidrezeptors
◼ Inaktive Form: Glucocorticoidrezeptor liegt im Cytosol gebunden an hsp90 und p59 vor
◼ Aktive Form: Bindung von Cortisol an den Zn2+ - Finger Rezeptor
◼ Dissoziation des inaktivierten Proteinkomplexes
◼ Wanderung des ligandengebundenen Rezeptors in den Zellkern
◼ Bindung an Enhancersequenzen und Aktivierung der Genexpression (Enzyme der Gluconeogenese)
Wie werden rekombinante Zink-Finger Proteine hergestellt und was ist der Vorteil?
◼ Durch Fusion einzelner Zn2+ -Finger Motive hergestellt
◼ 18 nt auf der DNA werden erkannt
◼ Spezifität erhöht sich
◼ Unterschiedliche Zn2+-Finger Motive erkennen unterschiedliche Tripletcode auf der DNA
◼ „Mischen“ unterschiedlicher Zn2+ -Finger Motive ermöglicht die Herstellung von rekombinanten Proteinen die hochspezifisch eine spezifische DNA Sequenz erkennen können.
Anwendung:
◼ Genkorrektur (echte Gentherapie)
◼ Erbliche monogene Erkrankungen mit defekten Genen
Was sind Mechanismen von Zink-Finger-Endonukleasen? (I)
◼ ZFN-Paar wird in eine Zelle verbracht
❑ (Transfektion, Electroporation, viraler Vektor)
◼ ZFN-Paar erzeugt Doppelstrang-Bruch
◼ Co-Transfektion mit einem Reparatur-Template
Was sind Mechanismen von Zink-Finger-Endonukleasen? (II)
◼ Homologe Reparatur
❑ Rekombination durch überlappende Sequenzen
❑ Zwischen der genomischen DNA und eingebrachten homologen Sequenzen
◼ Nicht-homologe Reparatur
❑ Reparatur durch zelleigene Proteine
❑ Zufällige Fehler entstehen (Deletionen/Insertionen)
◼ Nicht –homologe Reparatur Insertion
❑ Reparatur durch zelleigene Proteine
❑ Fremdsequenzen werden inseriert
Was ist das Ziel der Zink Endonuklease als HIV-Therapie?
Ausschalten des HIV Co-Rezeptors CCR5 in CD4+ T-Zellen
Was ist das Basic Leucin-Zipper Movie?
◼ Name durch regelmäßiges Vorkommen von Leucine alle 7 AS in d. a-Helix
◼ Durch sequentielle Anordnung sind alle hydrophoben Leucine an einer Seite der a- Helix angeordnet (hydrophobic core); Links- gängige Superhelix (engl. Coiled-Coil)
◼ hydrophobe Interaktion führt zu reißverschlussartiger (engl.: Zipper) Zusammenlagerung
◼ Leucin-Zipper selbst bindet nicht an DNA sondern dient nur zur Interaktions-Vermittlung zur Dimerisierung
Was ist das Helix-loop-Helix (HLH) Motive?
◼ Helix-Loop-Helix-Motiv
❑ Proteindomäne besteht aus zwei a-Helices + Schleife
❑ Hetero- oder Homodimerisierung mit Partner
◼ Bündel aus 4 Helices mit zwei basisches Enden entsteht
❑ Längere a-Helices ausgehend vom Dimerisierungsbereich stellen spezifische DNA-Kontakte her
❑ Beispiel MyoD (Transkriptionsfaktor, wichtig für die Muskeldifferenzierung)
◼ DNA-Bindung über β-Faltblattstruktur
❑ Beispiel: Eukaryontischer Transkriptionsfaktor NFκB
Was sind molekulare Interaktionen zwischen DNA-bindenen Proteinen und der DNA?
◼ H-Brückenbindungen
❑ zwischen Aminosäuren der Proteine und den Nukleotiden der DNA
◼ Metallionen
❑ Beispiel: Bindung des Transtriptionsaktivators ACE an die DNA erfolgt durch Einlagerung von 8 Kupfer-Ionen in das Protein
◼ Van der Vaal Bindungen
❑ Zwischen Zuckerresten der DNA und hydophober Oberfläche der Proteine
❑ Beispiel Bindung TBP mit der TATA Box
Können TF Homo- und Heterodimerisch sein?
Ja
Was sind die Untergruppen von Homo- und Heterodimerischen TF?
Dimerisierung:
❑ über Helix-Loop-Helix Motive
❑ Leucin Zipper
❑ Heterodimer (unterschiedliches Protein)
❑ Homodimer (gleiches Protein)
❑ Heterodimerisierung erhöht die
Gewebsspezifität der Transkription
Fos-Familie:
❑ keine Homodimere, müssen mit den TF der jun-Familie heterodimerisieren
❑ Jun-Jun, Jun-Fos binden präferentiell an TGACTCA
❑ Jun-ATF, ATF-Homodimere binden präferentiell an TGACGTCA
Welche Struktur haben DNA-erkennende Sequenzen von DNA Binding Proteins?
◼ 3-8 bp lang
◼ Struktur-Symmetrie
❑ Inverted repeat (Palindrom)
❑ Direkte Wiederholungen
◼ Typisch: Transkriptionsfaktoren binden als Dimer
◼ Bindung von heterodimerischen und homodimerischen Proteinen ist möglich
Was macht die (Trans)Aktivierungsdomäne aus?
❑ Essentiell für die Aktivierung
◼ Interagieren mit unterschiedlichen Proteinen und kooperieren bei der Transkription
◼ Können eine oder mehrere Transaktivierungsdomänen haben
◼ Keine generellen Strukturmotive:
❑ Glutamin-reiche Motive
❑ Proline-reiche Regionen
❑ hydrophobe b-Faltblattstruktur
Wie kann man Aktivierungsdomänen detektieren?
Fusionsproteine
Wie werden TF reguliert?
◼ Veränderungen in der Konzentration von regulatorischen DNA- Bindungsproteinen
◼ Regulation durch Bindung von Effektormolekülen
❑ Calcium
❑ Hormone
❑ Inhibitorische Proteinkomplexe
◼ Post-translationale Modifikation von Transkriptionsregulatoren
◼ Regulation durch Phosphorylierung
❑ Regulation der nukleären Lokalisation durch Phosphorylierung
❑ Phosphorylierung von DBD
❑ Phosphorylierung der AD
◼ Regulation durch Methylierung, Acetylierung und Redox-Modifikation
◼ Signal Transduction Networks
❑ Constitutiv aktive, regulatorische, entwicklungsabhängige TF
❑ Signal-abhängige TF
◼ Repression der Transkription
Was sind die Mechanismen der Regulierung der Aktivität von DNA binding Proteins?
◼ Bedeutender Mechanismus
Signale führen zum Transfer des Proteins vom Zytoplasma in den Zellkern
◼ Können in aktiver und inaktiver Form vorliegen
◼ Signale im Zytoplasma oder Nukleus führen zur Transition
◼ Daneben bestimmen die Aktivität
❑ Interaktionen mit dem Transkriptionsapparat
❑ Expressionsrate und Degradationsrate
Was sind die 3 Hauptwege zur Veränderung der Konzentartion von DNA-binding Proteinen?
❑ De novo Synthese
◼ Wichtig bei der Entwicklung und Differenzierung von Organismen
❑ Degradation (Proteolyse via Ub-Proteasome pathway)
❑ Subzelluläre Lokalisation
◼ Insbesondere Zytoplasma ↔ Nukleus
Was ist ein Beispiel für die Regulierung von TF durch Bindung von Effektormolekühlen? (I)
◼ Ca2+ - Ionen
❑ Schlüssel Effektor-Molekül in Eukaryonten
❑ Bindung an intrazelluläre Signalproteine
Was aktiviert und deaktiviert Ca2+?
Aktivierung: NFAT (nuclear-Factor of activated T-cells), allgemeiner TF vor allem in Immunzellen
Inaktivierung: DREAM (Transkriptionsrepressor, einziger TF der Ca2+ direkt bindet ohne DREAM keine Schmerzen)
wie können TF durch Bindung der Effektormoleküle Hormone reguliert werden?
❑ Zellkern-Rezeptoren
❑ Aktivierung durch Bindung von Liganden
◼ Aufhebung der Repression des Rezeptors durch Translokation in den Zellkern
❑ besonders Steroidhormone
Welche Hormone gehören zu den Steroidhormonen?
- Cortisol
- Aldosterone
- Progesterone
- Testosterone
- Vitamin D3(?)
Wie sieht der Steroidhormon-Pathway aus?
◼ Sterodidhormone werden durch Liganden aktiviert
❑ (Östrogen, Testosteron, Cortisol) im Zytoplasma
◼ Transfer in den Nukleus
◼ Aktivierung der Transkription
❑ Bindung an die DNA (Zink-finger)
❑ Interaktion mit Jun und Fos-Proteinen
wie können TF durch Bindung der Effektormoleküle Inhibitorische Proteinkomplexe reguliert werden?
❑ TF formt Komplex mit inhibitorischem Protein
❑ z.B. NFkB, + IkB = inaktiv
❑ Signal→Phosphorylierung von IkB = Proteolyse und Freisetzung von NFkB = aktiv
Welche Post-translationalen Modifikationen von TF gibt es?
❑ Phosphorylierung (Hauptmechanismus)
❑ Methylierung
❑ Acethylierung
❑ Redox-Modifikation
❑ Proteolyse
» Die meisten TF können verschieden
modifiziert werden und haben multiple und
unterschiedliche Modifikationen
Welche AS werden phosphoryliert bei der Regulation durch Phosphorylierung, wer ist bei der Regulation mit beteiligt und was wird reguliert?
◼ Phosphorylierung am Ser oder Thr, seltener an Tyr
◼ Beteiligt daran
❑ spezifische Proteinkinasen und Phosphatasen
◼ Reguliert wird
❑ Zellkernlokalisation
❑ DNA-Bindung
❑ Transaktivierung
Was wird bei der Regulierung durch Methylation und Acetylation methyliert bzw acetyliert?
❑ z.B. p53 (Zellzykluskontrolle)
❑ Reguliert durch Methylierung und Acetylierung von Arg oder Lys
Was ist die zentrale Bedeutung der Redox-Regulation
Reversible Oxidation von Cystein
◼ Unterschiedlicher Oxidationsstaus
❑ Sulfenic acid (-SOH),
❑ Sulfinic acid (-SO2)
❑ Sulfonic acid (-SO3),
❑ Disulfid (Cys-S-S-R)
❑ Nitrosothiol (-SNO)
❑ Reversible Oxidation von Cystein
◼ z.B. AP-1,
❑ enthält Cystein Motive
❑ Regulation durch oxidativen Stress
❑ Bindungsaktivität ist reduziert nach Oxidation
Wie werden TF bei bei dem Signal Transduktionsnetzwerk eingeteilt?
Konstitutiv aktive TF
❑ Im Nucleus aller Zellen, zu
jeder Zeit
❑ Keine spezifische Kontrolle
individueller Gene
❑ Housekeeping Gene
Regulatorische TF
❑ Zelltyp-spezifisch
❑ Abhängig von internen
und externen Signalen
Entwicklungs-abhängige TF
❑ Oft ohne post-translationale
Modifikation
Signal-abhängige TF
❑ Aktiv erst nach Aktivierung
durch spezifische Signale
Welche Arten von Aktivierung der Transkription durch Aktivatorproteine gibt es?
◼ 1. Aktivierung durch niedrig
molekulare Hormone
❑ Zellkern-Rezeptor Familie (Steroid-Rezeptor Superfamilie)
◼ 2. Aktivierung durch interne Signale
❑ z.B. durch Erhöhung der intrazellulären
Sterol –Konzentration (SREBP)
❑ p53 aktiviert durch DNA-Damage
◼ Aktivierung durch
Oberflächenrezeptor-Ligand-
Interaktion
❑ 3. Resident nuclear factors
◼ Permanent im Zellkern
◼ Aktivierung durch Phosphorylierung
❑ 4. Latent cytoplasmatic factor
◼ Im Zytoplasma
◼ Translokation in den Zerllkern und Aktivierung durch Phosphorylierung
◼ Oft Proteolyse notwendig zur vollen Aktivierung
Welche Arten von Inhibitation der Transkription durch Repressor-Proteine gibt es?
◼ Unspezifische Repression
❑ Repression der Chromatinstruktur (1)
◼ Spezifische Repression (an die DNA
Sequenz gebunden)
❑ Inhibiert die Transkriptionsinitiation (2)
❑ Inhibierung durch Bindung an TF (3, 4)
❑ Inhibierung durch Bindung an „Silencer“ Sequenzen (5)
◼ Repressor hat eine Repressor-Domäne (z.B. KRAB)
◼ Weitere Mechanismen:
❑ Heterodimerisierung
❑ Phosphorylierung
❑ Cytosolische Retention
❑ Bindung von Inhibitoren
Wovon kann es abhängig sein, ob ein Protein ein Repressor oder Aktivator ist?
❑ der Umgebung
❑ Vorhandensein anderer TF
❑ spezifischen niedermolekularer Substanzen
❑ z.B. Vitamin A-Säure:
◼ minus Ligand: DNA-Bindung und Repression
◼ plus Ligand: DNA-Bindung und Aktivierung
