Regulation der Genexpression TF Flashcards
Was sind die Kernaussagen der VL?
◼ Transkriptionsfaktoren haben einen modularen Aufbau mit verschiedenen Domänen für DNA-Bindung, Aktivierung, Dimerisierung und Regulation
◼ Es gibt drei wichtige DNA-DBD-Motive (basic leucin zipper, helix-turn-helix und Zn2+-Finger)
◼ Rekombinante Zn2+-Finger-Proteine können zur Genkorrektur verwendet werden
◼ TF können Homo- und Heterodimere bilden
◼ TF werden durch Effektormoleküle über Phosphorylierung, Methylierung, Acethylierung, Redox-Regulation reguliert, was ihre DNA-Bindung, Translokation in den Nukleus und Transaktivierung beeinflusst
Was sind Sequenzspezfische DNA-Bindeproteine? (STF)
◼ Typische modulare Struktur mit unterschiedlichen Domänen
◼ Bindung an die cis-Elemente
❑ Registrierung von Signalen
❑ Übermittlung von Signalen an die RNA Pol, den Mediator- Komplex und das Chromatin
❑ Mehr als 2000 werden durch das humane Genom kodiert
◼ Transkriptions-Aktivatoren/-Repressoren
❑ abhängig von Chromatin assoziierten Proteinen
Von N Richtung C Terminus, wie sind STF’s aufgebaut?
N»_space; DNA Bindung»_space; Dimerisierung»_space; Aktivierung»_space; Regulation»_space; C
Was sind DNA-Bindungsdomänen?
◼ Oft separate Struktureinheit im Protein
◼ Falten sich unabhängig von anderen Domänen des Proteins
◼ Stabilisiert durch andere Elemente des Proteins (kurze a-Helix und b-Faltblattstrukturen)
◼ Bindung hauptsächlich an die große Furche der DNA
◼ a-Helix passt gut in diese Furche, deshalb hierüber die Interaktion mit der DNA
Was sind Strukturen von DNA binding Protein Domains (DBD)
- Helix-turn-Helix
- Zinkfinger
- Leucin Zipper
Was sind Helix-turn-Helix Motive?
◼ Zwei a-Helices, die über einen kurzen b-Faltblattstiel aus Aminosäuren verbunden sind
◼ Bindungssequenzen in der DNA sind Palindrome,
❑ d.h. sie sind aus zwei invertierten, spiegelbildlich angeordneten Sequenzen in zwei aufeinanderfolgenden großen Furchen der DNA
◼ Erkennungshelix: Bindung an die große Furche der DNA
❑ Wechselwirkung über Wasserstoff-Brücken, Ionenbindung, hydrophobe Wechselwirkung
❑ Stabilisierung der DNA und Erhöhung der Spezifität
◼ Dimerisierungshelix:
❑ Stabilisierung der Bindung an die DNA
> > Passgenaue Bindung in zwei aufeinanderfolgenden großen Furchen
Was ist das Zink-Finger Motive (I)?
◼ Zn2+-Finger 30 Aminosäuren lange Proteindomäne
◼ Meist Bestandteil von Transkriptionsfaktoren und Steroidhormonrezeptoren (z.B. Glucocorticoidrezeptor)
◼ Zn2+ als Zentralatom mit vier Liganden verbunden
❑ Möglichkeiten zinc-Cys2-His2, zinc- Cys4, zinc2-Cys6
Was ist das Zink-Finger Motive (II)?
◼ Dimerisierung der Zinc-Finger enthaltenden Proteine und Bindung der a-Helix in der großen Furche der DNA
◼ Zn2+ -Bindungselement sorgt für Ausrichtung der Erkennungshelix, bindet selbst nicht an die DNA
◼ In Abwesenheit von Zn2+-Ionen oder Liganden (Veränderung in der Struktur) zerfällt der dimerische Komplex und löst sich von der DNA)
Was ist as Zink-Finger Motive (III)?
◼ Zn2+-Finger können nahezu spezifisch an jede DNA Sequenz binden
◼ 3 Aminosäuren (Position -1, 3 und 6 in der Helix) interagieren mit jeweils 3 Nukleotiden auf dem kodierenden Strang der DNA und die Aminosäure an Position 2 mit dem Komplementärstrang über hydrophobe Interaktionen
Was ist ein Beispiel eines Zink-Finger Proteins?
Aktivierung des Glucocorticoidrezeptors
◼ Inaktive Form: Glucocorticoidrezeptor liegt im Cytosol gebunden an hsp90 und p59 vor
◼ Aktive Form: Bindung von Cortisol an den Zn2+ - Finger Rezeptor
◼ Dissoziation des inaktivierten Proteinkomplexes
◼ Wanderung des ligandengebundenen Rezeptors in den Zellkern
◼ Bindung an Enhancersequenzen und Aktivierung der Genexpression (Enzyme der Gluconeogenese)
Wie werden rekombinante Zink-Finger Proteine hergestellt und was ist der Vorteil?
◼ Durch Fusion einzelner Zn2+ -Finger Motive hergestellt
◼ 18 nt auf der DNA werden erkannt
◼ Spezifität erhöht sich
◼ Unterschiedliche Zn2+-Finger Motive erkennen unterschiedliche Tripletcode auf der DNA
◼ „Mischen“ unterschiedlicher Zn2+ -Finger Motive ermöglicht die Herstellung von rekombinanten Proteinen die hochspezifisch eine spezifische DNA Sequenz erkennen können.
Anwendung:
◼ Genkorrektur (echte Gentherapie)
◼ Erbliche monogene Erkrankungen mit defekten Genen
Was sind Mechanismen von Zink-Finger-Endonukleasen? (I)
◼ ZFN-Paar wird in eine Zelle verbracht
❑ (Transfektion, Electroporation, viraler Vektor)
◼ ZFN-Paar erzeugt Doppelstrang-Bruch
◼ Co-Transfektion mit einem Reparatur-Template
Was sind Mechanismen von Zink-Finger-Endonukleasen? (II)
◼ Homologe Reparatur
❑ Rekombination durch überlappende Sequenzen
❑ Zwischen der genomischen DNA und eingebrachten homologen Sequenzen
◼ Nicht-homologe Reparatur
❑ Reparatur durch zelleigene Proteine
❑ Zufällige Fehler entstehen (Deletionen/Insertionen)
◼ Nicht –homologe Reparatur Insertion
❑ Reparatur durch zelleigene Proteine
❑ Fremdsequenzen werden inseriert
Was ist das Ziel der Zink Endonuklease als HIV-Therapie?
Ausschalten des HIV Co-Rezeptors CCR5 in CD4+ T-Zellen
Was ist das Basic Leucin-Zipper Movie?
◼ Name durch regelmäßiges Vorkommen von Leucine alle 7 AS in d. a-Helix
◼ Durch sequentielle Anordnung sind alle hydrophoben Leucine an einer Seite der a- Helix angeordnet (hydrophobic core); Links- gängige Superhelix (engl. Coiled-Coil)
◼ hydrophobe Interaktion führt zu reißverschlussartiger (engl.: Zipper) Zusammenlagerung
◼ Leucin-Zipper selbst bindet nicht an DNA sondern dient nur zur Interaktions-Vermittlung zur Dimerisierung
Was ist das Helix-loop-Helix (HLH) Motive?
◼ Helix-Loop-Helix-Motiv
❑ Proteindomäne besteht aus zwei a-Helices + Schleife
❑ Hetero- oder Homodimerisierung mit Partner
◼ Bündel aus 4 Helices mit zwei basisches Enden entsteht
❑ Längere a-Helices ausgehend vom Dimerisierungsbereich stellen spezifische DNA-Kontakte her
❑ Beispiel MyoD (Transkriptionsfaktor, wichtig für die Muskeldifferenzierung)
◼ DNA-Bindung über β-Faltblattstruktur
❑ Beispiel: Eukaryontischer Transkriptionsfaktor NFκB
Was sind molekulare Interaktionen zwischen DNA-bindenen Proteinen und der DNA?
◼ H-Brückenbindungen
❑ zwischen Aminosäuren der Proteine und den Nukleotiden der DNA
◼ Metallionen
❑ Beispiel: Bindung des Transtriptionsaktivators ACE an die DNA erfolgt durch Einlagerung von 8 Kupfer-Ionen in das Protein
◼ Van der Vaal Bindungen
❑ Zwischen Zuckerresten der DNA und hydophober Oberfläche der Proteine
❑ Beispiel Bindung TBP mit der TATA Box
Können TF Homo- und Heterodimerisch sein?
Ja
Was sind die Untergruppen von Homo- und Heterodimerischen TF?
Dimerisierung:
❑ über Helix-Loop-Helix Motive
❑ Leucin Zipper
❑ Heterodimer (unterschiedliches Protein)
❑ Homodimer (gleiches Protein)
❑ Heterodimerisierung erhöht die
Gewebsspezifität der Transkription
Fos-Familie:
❑ keine Homodimere, müssen mit den TF der jun-Familie heterodimerisieren
❑ Jun-Jun, Jun-Fos binden präferentiell an TGACTCA
❑ Jun-ATF, ATF-Homodimere binden präferentiell an TGACGTCA
Welche Struktur haben DNA-erkennende Sequenzen von DNA Binding Proteins?
◼ 3-8 bp lang
◼ Struktur-Symmetrie
❑ Inverted repeat (Palindrom)
❑ Direkte Wiederholungen
◼ Typisch: Transkriptionsfaktoren binden als Dimer
◼ Bindung von heterodimerischen und homodimerischen Proteinen ist möglich
Was macht die (Trans)Aktivierungsdomäne aus?
❑ Essentiell für die Aktivierung
◼ Interagieren mit unterschiedlichen Proteinen und kooperieren bei der Transkription
◼ Können eine oder mehrere Transaktivierungsdomänen haben
◼ Keine generellen Strukturmotive:
❑ Glutamin-reiche Motive
❑ Proline-reiche Regionen
❑ hydrophobe b-Faltblattstruktur
Wie kann man Aktivierungsdomänen detektieren?
Fusionsproteine
Wie werden TF reguliert?
◼ Veränderungen in der Konzentration von regulatorischen DNA- Bindungsproteinen
◼ Regulation durch Bindung von Effektormolekülen
❑ Calcium
❑ Hormone
❑ Inhibitorische Proteinkomplexe
◼ Post-translationale Modifikation von Transkriptionsregulatoren
◼ Regulation durch Phosphorylierung
❑ Regulation der nukleären Lokalisation durch Phosphorylierung
❑ Phosphorylierung von DBD
❑ Phosphorylierung der AD
◼ Regulation durch Methylierung, Acetylierung und Redox-Modifikation
◼ Signal Transduction Networks
❑ Constitutiv aktive, regulatorische, entwicklungsabhängige TF
❑ Signal-abhängige TF
◼ Repression der Transkription
Was sind die Mechanismen der Regulierung der Aktivität von DNA binding Proteins?
◼ Bedeutender Mechanismus
Signale führen zum Transfer des Proteins vom Zytoplasma in den Zellkern
◼ Können in aktiver und inaktiver Form vorliegen
◼ Signale im Zytoplasma oder Nukleus führen zur Transition
◼ Daneben bestimmen die Aktivität
❑ Interaktionen mit dem Transkriptionsapparat
❑ Expressionsrate und Degradationsrate
