Regulation der Genexpression Splicing-RNAi

Question 1

Was ist die Zusammenfassung der VL

Answer 1

◼ Post-transcriptional regulation of gene expression occurs on the level of pre-mRNA splicing and by RNA interference
◼ Activator and suppressor signals and proteins are involved in this process
◼ RNA interference (RNAi) is a key mechanism of post-transcriptional gene silencing
◼ RNAi is mediated by si, sh and microRNA, which are processed by the siRNA pathway
◼ RNAi is a powerful tool for experimental investigations
and therapeutic application (e.g. antiviral therapy,restriction of vector mediated transgene expression)

Question 2

Wofür steht das i bei RNAi

Answer 2

RNA Interferenz

Question 3

Was ist der Hauptmechanismus des post-transkriptionalen Gene Silencings?

Answer 3

❑ Translationsblockade / Abschalten von Genen
❑ Antiviraler Abwehrmechnismus
❑ Einsatz für die Therapie verschiedenster
Erkrankungen

Question 4

Was sind die Classes der small RNAs kodiert

Answer 4

◼ Endo-siRNA (endogenous small interfering RNA)
❑ 20-23 nt
❑ in Geschlechtszellen
❑ Embryonale Stammzellen
◼ miRNA (microRNA)
❑ 20-23 nt
❑ In allen Zellen
◼ piRNA (piwi-interacting RNA)
❑ 24-31 nt
❑ Ausschließlich in Geschlechtszellen
❑ Essentiell für die Spermiogenese
❑ Besonderheit: Prozessierung erfolgt durch Piwi-Proteine und
nicht durch DICER
» Unterscheidung nach Herkunft nicht nach Funktion

Question 5

Was ist der Ablauf des siRNA Pathways mit dem Ausgangspunkt: lange dsRNA?

Answer 5

❑ Dicer (RNAse III Endonuklease)
◼ Schneidet dsRNA
❑ dsRNA wird entwunden unter Verbrauch
von ATP
❑ DICER-„guide“ RNA-Strang –Komplex
kommt in Kontakt mit Argonaut-
Proteinen
❑ RISC (Multienzymkomplex) bildet sich,
führt „guide“-Strang an die Target RNA
(komplementäre Basenpaarung)
❑ Schneiden der Ziel RNA durch
Agonaut 2 (Ago2)

Question 6

Was ist der Dicer und aus woraus besteht er?

Answer 6

Endoribonuklease
❑ zwei RNase III-Domänen (RIIIDa
und RIIIDb)
◼ schneiden die RNA 3‘ und 5‘
❑ PAZ Domäne
◼ für siRNA Übernahme
❑ Helicase
◼ bestimmt die Länge der
entstehenden siRNA
❑ dsRNA Bindungsstelle (dsRBD)
◼ erkennt ssRNA–dsRNA
Verbindung
❑ arbeitet als dimerisches Protein
◼ eines der aktiven Bereiche von
Dicer ist defekt, dadurch erfolgt
Slicen alle 21 nt

Question 7

Was passiert beim Processing der dsRNA durch den DICER?

Answer 7

◼ Erzeugung eines kurzen dsRNA
Moleküls
◼ 2nt Überhänge am 3‘ Ende
◼ Guide-Strang
❑ Thermodynamische Stabilität
am 5‘ Ende entscheidet, welcher
Strang als Guide selektiert wird
◼ Passenger-Strang
❑ wird abgebaut

Question 8

Was ist RISC und aus welchen Enzymen besteht es?

Answer 8

RNA-induced Silencing Complex&raquo_space; Multienzymkomplex
❑ DICER
❑ dsRNA bindende Proteine (TRBP, PACT)
◼ Transportieren DICER – siRNA zum RISC
❑ R2D2
◼ Differenzierungsfaktor hilft beim Laden des „guide“ Strand in den RISC
❑ Argonaute 2 (Hauptkomponente)
◼ PAZ Domäne
❑ (für siRNA Übernahme)
◼ PIWI Domäne
❑ RNase H-like Endonuklease Aktivität
❑ Spaltet Phosphodiesterbindungen in der Ziel RNA

Question 9

Was sind Untergruppen von siRNAs

Answer 9

◼ tasiRNA (vom trans-acting siRNA)
❑ Doppelsträngiger Precursor mit pA Signal
❑ Keine 100% Homologie zur Zielsequenz notwendig
❑ Translationsstop, Cleavage
❑ In Landpflanzen, Nematoden
◼ rasiRNA (repeat associated siRNA)
❑ Sense und antisense Stränge, die sich aneinander lagern
❑ 20-25 nt lang
❑ Histon/DNA Methylierung, Heterochromatinformation, mRNA Cleavage
❑ Silencing von Retrotransposons und Transposons
❑ Drosophila, einzellige Eukaryonten, nicht in Säugern
◼ scnRNA (small-scan siRNA)
❑ Zellkern assoziiert
❑ H3K9 Methylierung

Question 10

Was sind 2 Funktionen von siRNAs?

Answer 10

◼ 1. RNA induzierte Chromatinveränderungen dienen der Stillegung invasiver Sequenzen
(Retroviren, Transposons)
◼ 2. frühe Embryogenese:
Transkriptionsinhibierung bei einem der zwei X-Chomosomen bei weiblichen Säugern durch X-inactive specific transcript, Xist,
❑ Histonmodifikation/DNA-Methylierung)

Question 11

Was sind micro RNAs und zu was sind sie komplementär?

Answer 11

◼ Einzelsträngige kurze RNA
Moleküle
◼ Komplementär
❑ zu Bindungsorten in der 3‘UTR (Tiere)
❑ zu kodierender Region (Pflanzen)

Question 12

Aus was sind microRNAs generiert?

Answer 12

❑ Sequenzen zw. Genen (häufigst)
❑ Intronsequenzen
❑ Exonen (selten)
❑ miRNA Gene
❑ oft polycistronisch (mehrere
miRNAs werden prozessiert)

Question 13

In welche 4 Klassen werden microRNAs klassifiziert?

Answer 13

❑ 1. Intronische miR in nicht-kodierenden Transkripten
◼ Ca. 40 % der miR
❑ 2. Exonische miRs in nicht-kodierenden Transkripten
◼ Ca. 10 % der miR
❑ 3. Intronische miR in Protein-kodierenden Transkripten
◼ Ca. 40 % der miR
❑ 4. Exonische miR in Protein-kodierenden Transkripten
◼ Ca. 10 % der miR

Question 14

Woraus besteht der microRNA Pathway?

Answer 14

◼ Prozessierung eines Hairpin-Transkripts über RNAse III (Drosha/Dicer)
◼ „Antisense“-RNA Strang („Guide“-Strang) lagert an die Targetsequenz der mRNA
◼ Argonauten Proteine (AGO1 bis AGO8)
❑ AGO2: schneidet
❑ Andere AGO rekrutieren andere Enzyme und vermitteln einen Translationsstopp

Question 15

Welche Schritte hat das microRNA (miRNA) Processing?

Answer 15

◼ Pri-miRNA
◼ Pre-miRNA
◼ miRNA-Duplex
◼ Maturated miRNA

Question 16

Was entscheidet, ob eine Degradation oder ein Translationsstopp erfolgt?

Answer 16

◼ Grad der Komplementarität zwischen microRNA und target Sequenz entscheidet, ob eine Degradation erfolgt oder ein
Translationsstop
◼ Wichtig bes. nt 10-11 (dort erfolgt das Schneiden)

Question 17

Was ist die Seed-Region und was ist wichtig in Bezug auf die microRNA?

Answer 17

„Seed“-Region“: Nukleotid 2-7 am 5‘ Ende der microRNA als Erkennungs-Sequenz für die Zielsequenz in der Target mRNA

Wichtig:
◼ Gleiche „Seed-Region“ in verschiedenen mRNAs, deshalb kann
eine microRNA viele mRNAs regulieren
◼ Mehrere Bindungsorte für eine microRNA in einer 3‘UTR, höhere
inhibitorische Effizienz

Question 18

Werden microRNAs gewebespezifisch exprimiert?

Answer 18

Ja

Question 19

Was ist Gene Silencing durch RNAi Technologien und was sind die Anwendungsgebiete?

Answer 19

◼ Alle Ansätze bei denen die Expression von Genen ausgeschaltet werden soll
◼ Gezieltes Einbringen der siRNAs in die Zielzellen
◼ Spezifischer und effizienter als andere post-translationale Inhibitormoleküle (Ribozyme, antisense Oligonukleotide)

Anwendungsgebiete:
❑ Loss of function Studien (experimentell), in vitro und in vivo
❑ Herstellung von k.o. Modellen
❑ Therapeutische Ansätze
◼ Antivirale Therapie
◼ gezielte Ausschaltung von Repressormolekülen oder Aktivatorproteinen
❑ Tumortherapie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen etc.

Question 20

Welche zwei Wege gibt es um siRNAs in Zellen zu bringen?

Answer 20

siRNAs:
❑ Transfektion, Electroporation (in vitro)
❑ Direkte Injektion (Nasenspray), hydrodynamische Applikation (Leber)
❑ Nanopartikel
❑ Kurzzeitwirkung – Modifikationen der siRNA ermöglichen
Langzeitwirksamkeit
shRNAs/aritifizielle microRNAs:
❑ Plasmid oder virale Vektoren
❑ Organspezifische Expression
❑ Langzeitwirksamkeit, da ständig exprimiert

Question 21

Was sind die Classes der Small Regulatory RNAs für RNAi?

Answer 21

siRNA: vom Genom transkribiert synthetisch hergestellt
shRNA: künstliche Struktur von Vektoren exprimiert
miRNA: vom Genom transkribiert
amiRNA: künstliche Struktur von Vektoren exprimiert

Question 22

Was sind Kriterien für die Auswahl von siRNAs?

Answer 22

◼ Aufsuchen einer 19-21 nt Sequenz in der Target mRNA, welche mit dem Dinukleotid AA beginnt
❑ 3’ UU-Überhänge an den siRNAs gewährleisten die höchste Aktivität
❑ andere Überhänge sind möglich, aber kein G (RNAse Sensitivität steigt)
◼ Das erste Nukleotide in der siRNA sollte ein A oder G sein, da die Expression von Pol III Promotoren ineffizient ist, wenn ein C oder T vorliegt
◼ Keine TTTT oder AAAA Sequenzen, wenn shRNAs von einem Pol III Promotor exprimiert werden (TTTT = Stopsignal)
◼ GC Gehalt zw. 30 und 50 %
◼ Vermeiden von 5’ und 3’ Regionen in der Ziel-mRNA (Bindungsorte für regulatorische Proteine, welche RISC Bindung inhibieren können)
◼ Vermeiden von Bereichen mit komplexer mRNA Struktur (hairpin loops)
◼ Nicht mehr als 13 Nukleotide Sequenzhomologie zu nicht-Target mRNAs (vermeiden von Off-Target Effekten)
◼ shRNA loops sind 5, 7, oder 9 nt lang (TCAAGAG)
◼ 2-4 verschiedene siRNAs auswählen
❑ Trotz Selektion zeigen oft nur 1 von 4 siRNAs eine Effizienz von 75-95%, der Rest liegt i.d.R. bei 50 % oder funktioniert gar nicht

Question 23

Was sind siRNA Auswahl-Programme?

Answer 23

◼ Invitrogen
◼ Ambion
◼ Qiagen etc.
◼ Equivalente
Programme zum Aufsuchen von sh und microRNAs

Question 24

Was ist ein Beispiel für ein Short-time Effekt von siRNA?

Answer 24

Phospholamban (PLB)-Knockdown durch siRNAs:
◼ Bereits 3-4 Tage nach Transfektion der PLB-siRNAs erreicht die
PLB Expression wieder normales Niveau.

Question 25

Was sind Wege um eine CVB3 Infektion zu inhibieren mit RNAi?

Answer 25

◼ Blockade des Coxsackie-Adenovirus-
Rezeptors (CAR)
◼ Intrazellulär Schneiden der CVB3 RNA