Quiz laboration

Question 1

Ungefär hur många olika proteiner frigörs vid lysering av E. coli?

Answer 1

Det finns cirka 2000 andra typer av proteiner i cytoplasman, förutom detta finns 100 olika sorter i periplasman, plus en hel del membranbundna.

Question 2

Hur skulle man kunna göra för att minska bakgrundsmängden?

Answer 2

För att minska bakgrundsmängden skulle de proteiner man vill ha ut kunna överuttryckas, då kommer de andra automatiskt att bli färre. Alternativt att få E. coli att sekretera proteinet till periplasman där antalet proteiner är färre.

Question 3

Vad är det för andra molekyler som bör renas bort?

Answer 3

Till exempel andra varianter av målproteinet, DNA, celldebris, pigment, lipider, endotoxiner samt virus.

Question 4

Varför är det viktigt att direkt frysa ned skördad supernatant från HEK293 cellerna?

Answer 4

För att undvika att de aggregerar.

Question 5

Vad har lysozym för funktion under lyseringen?

Answer 5

Lysozym är ett enzym som används för att komma åt de intracellulärt producerade proteinerna. Dess funktion är att bryta ned lagret av peptidoglykan i cellväggen.

Question 6

Vad har DNAse för funktion?

Answer 6

DNAse används då lyseringen frigör DNA vilket måste tas bort för att undvika viskositet i provet eller att de interagerar under kromatografisteg. DNAse har som funktion att den bryter bindningen i DNA’ts backbone och bryter således ner DNA:t.

Question 7

Vad hamnar i supernatant respektive pellet under centrifugeringen?

Answer 7

Efterfrågat konstrukt återfinns i supernatanten medan cellerna hamnar i pelleten.

Question 8

Vad är en isoelektrisk punkt?

Answer 8

Den punkt på en molekyl där laddningarna tar ut varandra, nettoladdningen är lika med 0. Ett pH under pI ger en positiv laddning på proteinet och ett pH över Ip en negativ laddning.

Question 9

Vad påverkar pI för ett protein?

Answer 9

Hur många basiska eller sura aminosyror det har där många basiska ger ett högt pH.
pI kan påverka löslighet, bestämma om man ska använda katjon/anjonbytare. Ett proteins pI bestäms av proteinets aminosyror.

Question 10

Vilken sorts jonbytare bör du använda om du vill rena fram ett protein i en buffert under dess pI.

Answer 10

Då kommer provet vara positivt och därför används katjonbytare.

Question 11

Vad bör du tillsätta vid gradient-eluering från en jonbytare?

Answer 11

Salt

Question 12

Vad kommer att hända med proteinerna om du tillsätter urea i bufferten?

Answer 12

Urea används som denaturerande reagens och förstör därför proteinstrukturen. De löser även upp inklusionskroppar.

Question 13

Inom vilket pI-intervall befinner sig intracellulära proteiner vanligtvis i E. coli?

Answer 13

Surt, ca. 4-7 (dvs. negativt laddade vid fysiologiskt pH).

Question 14

Vad kallas den kromatografimetod som använder specifika protein:protein interaktioner för separation?

Answer 14

Affinitetskromatografi eller HIC/RPC

Question 15

Vilka metalljoner används vanligen för IMAC och vilket motiv binder dessa in till?

Answer 15

Ni2+, Cu2+ Zn2+, Co2+ där Nickel är vanligast. De binder till en chelator (och en His-tag).

Question 16

Hur kan du eluera His-taggade proteiner?

Answer 16

Imidazole. Eller EDTA som binder metalljonerna. (Genom att använd pH under 7 vilket sänker His förmåga att binda.)

Question 17

Vad bör man tänka på med en matris där ett protein som t.ex IgG används som ligand?

Answer 17

Matrisen är känsligare än de för exempelvis jonbytare och SEC-matriser vid rening. Detta påverkar rengöringen då den inte klarar vanliga CIP-protokoll. Rätt pH behövs för att binda in, gynna interaktionen. Ibland behövs en extra co-faktor för att få rätt konformation. Flödeshastigheten behöver anpassas om interaktionen tar tid. Dessutom är det tuffa elueringsförhållanden.

Question 18

Vad händer med antikroppen under reducerande förhållanden, vilka bindningar kan påverkas?

Answer 18

Antikroppen innehåller disulfid-bryggor vilka bryts under reducerande förhållanden vilket innebär att den förlorar sin aktivitet och således funktion.

Question 19

Hur kommer en antikropp att se ut på en reducerande gelelektrofores? Kommer skillnad ses mellan provet som behandlas med DTT och det nativa eller inte?

Answer 19

Eftersom att den reducerade har delats upp i två (heavy chain och light chain har ju separerats) så borde de således befinna sig på tre ställen. Light chainsen borde ha vandrat längst, sedan heavy chains och sist de största nativa antikropparna.

Question 20

Varför skiljer sig produktionen av detta konstrukt ifrån de övriga konstrukten?

Answer 20

Antikroppar kräver PTM vilket bakterier inte utför och dessutom kan bakterier inte vecka den komplicerade strukturen rätt med disulfidbryggor osv. Därför är detta ej en passande värd som för de övriga två konstrukten.

Question 21

Hur kan man bryta bindningen mellan protein A och IgG?

Answer 21

Genom att eluera med lågt pH, exempelvis 0,1 M glycin i pH 3.

Question 22

Varför bör du tillsätta DTT vid klyvning med Proteas 3C?

Answer 22

Proteas 3C klyver en specifik aminosyrasekvens vilket innebär att man kan rena bort en tag och är optimalt under reducerande förhållanden. DTT är en antioxidant som förhindrar bildning av disulfid-bryggor och därför bör den tillsättas.

Question 23

Hur kan DTT påverka kolonnen? Vad för mellansteg kan behövas efter användningen av DTT?

Answer 23

MabSelect matrisen klarar exempelvis inte av DTT så provet behöver buffertbytas innan rening.

Question 24

Vad kommer hända om du tillsätter NaOH till din buffert?

Answer 24

NaOH kommer att göra den basisk och en för hög koncentration kommer att denaturera proteiner samt göra dem negativt laddade (om de inte har ett väldigt högt pI).

Question 25

Vad bör man tänka på när man packar en kolonn med matris?

Answer 25

Vid kolonnpackning av matris är det viktigt att undvika kanaler i packningen. En del matriser behöver också svälla i sin buffert innan de packas, dessa kallas för xerogeler. Luftbubblor ska också undvikas, detta är viktigare ju längre kolonnen är då de påverkas mer. Tänk också på att hälla på matrisen med ett jämnt flöde och att den aldrig får bli torr.

Question 26

Varför läggs filtren i 70% etanol innan packning av kolonnen?

Answer 26

För att minska risken för kontamination då man ska rena sitt prov.

Question 27

Vilken matris är det viktigast att vara noggrann att undvika kanaler i när man packar: Talon-C02+ eller Superdex 75?

Answer 27

Talon-Co2+ binder His taggar och Superdex 75 är en matris för storleksseparation. Det är viktigare att en SEC-matris inte har kanaler eftersom man vill sortera molekylerna efter storleksordning. Detta genererar breddning av topp. Om IMAC:en har kanaler så spelar inte det lika stor roll då alla histaggar ska binda in förr eller senare, det spelar heller ingen roll vart, eftersom alla med his-tag ändå bara ska sköljas ut i ett steg.

Question 28

Vilket pH bör du ha vid påladdning på kolonnen?

Answer 28

Fysiologiskt pH där proteinerna trivs.

Question 29

Vilken matris är det viktigast att vara noggrann att undvika kanaler i när man packar: Talon-CO2+ eller Superdex 75?

Answer 29

Talon-Co2+ binder His taggar och Superdex 75 är en matris för storleksseparation. Det är viktigare att en SEC-matris inte har kanaler eftersom man vill sortera molekylerna efter storleksordning. Detta genererar breddning av topp. Om IMAC:en har kanaler så spelar inte det lika stor roll då alla histaggar ska binda in förr eller senare, det spelar heller ingen roll vart, eftersom alla med his-tag ändå bara ska sköljas ut i ett steg.

Question 30

Vilka fördelar och nackdelar finns med manuell bordsrening jämfört med reningssystem med pump och mixer?

Answer 30

Pump och mixer = ÄKTA maskiner, Mixer = två eluenter som mixas så att man kan få en gradient. Ska man bara göra en enda separation så är det betydligt bättre att använda en bordskolonn. Manuell är mycket mildare.

Question 31

Vilka aminosyror bidrar mest till absorbans vid 280 nm?

Answer 31

De aromatiska aminosyrorna.

Question 32

Vilka fördelar finns med att samla upp elueringen i fraktioner? Hur stora fraktioner är lagom, vad beror det på?

Answer 32

Om man eluerar med en gradient så kan man få olika typer av proteiner i olika prov om man delar upp det i fraktioner. Fraktionerna i ÄKTA är 1 mL, och kyvetter i abs är 1 mL. Fraktioner som är för stora kan råka få med olika typer.

Question 33

Vilka aminosyror bidrar mest till absorbans vid 280 nm?

Answer 33

De aromatiska aminosyrorna.

Question 34

Kan proteinernas extinktionskoefficient påverkas av buffertens egenskaper?

Answer 34

Koefficienten baseras på antalet aromatiska aa i proteinet samt hur de är fördelade på ytan. Om bufferten påverkar laddning eller bindningar kan koefficienten påverkas.

Question 35

Åt vilken elektrod kommer proteinerna vandra?

Answer 35

Genom att sätta till den negativa detergenten sodium dodecyl sulfat (SDS) blir samtliga proteiner starkt negativa oavsett ursprungligt pI, och därigenom sker separationen främst på storlek. Eftersom proteinerna är negativt laddade, så kommer de vandra mot pluspolen.

Question 36

Vilken funktion fyller beta-mercaptoethanol (2ME) vid en SDS-PAGE? När skulle man inte vilja tillsätta detta till sitt prov?

Answer 36

Den klyver disulfidbryggor. Vill ej tillsätta detta om man har antikroppar för att den tappar sin funktion då.