Föreläsning 5

Question 1

Vilka reningsprinciper är baserade på affinitet?

Answer 1

Bindningsyta, kolhydrater och metallbindande.

Question 2

Vad händer om passformen förstörs?

Answer 2

Interaktionerna bryts och affiniteten minskar.

Question 3

Beskriv affinitetskromatografi?

Egenskaper och krav.

Answer 3

Ofta selektiv.
Rening & konc. i samma steg.
Bindning måste vara reversibel. Bör även vara stark bindning.
Bra som tidigt reningssteg, men ej första. Pga dyra, känsliga matriser.

Question 4

Vilket steg i CIPP är ofta affinitetsbaserat?

Answer 4

Intermediate Purification.

Question 5

Vilka faktorer bör beaktas vid affinitetskromatografi?

Answer 5

Val av matris.
Val av ligand.
Ligandtäthet (kan ej vara för tätt mellan ligand & matris ifall målprotein är stort, måste ha bra avstånd mellan ligander).
Rätt förhållanden för inbindning.
Buffert där ligand & målprotein håller struktur.

Question 6

Hur ska matrisen vara för affinitetskromatografi?

Answer 6

Minimal ospecifik interaktion. 
Makroporös, stor yta, många molekyler kan passera. 
Tåliga mot höga flöden. 
Stabila under reningsförhållanden. 
Aktiva grupper där ligand kan kopplas.

Question 7

Hur ska liganderna vara för affinitetskromatografi?

Answer 7

Affinitet nog att fånga målprotein. 
Hög specificitet. 
Reversibel bindning. 
Stabilitet under reningsförhållanden. 
Möjlighet att fästa på matris.

Question 8

Gruppspecifika ligander:

Answer 8

Protein A/G - Antikroppar.
Heparin - koagulationsprotein, enzym, tillväxtfaktor.
Lectiner - protein med glykosylering.
DNA - DNA-bindande protein

Question 9

Ligandexempel:

Answer 9

Substrat/inhibitor - enzym.
Antikropp - antigen/cell/virus.
Hormon/vitamin - receptorer.
Komplementära baser - nukleinsyror.

Question 10

Vad används spacer för? Vad är det?

Answer 10

Ofta kolkedja på 6-10 kolatomer.

Används för att få ut ligand från matriskulan.

Question 11

Vad ska man tänka på för mobila fasen vid inbindning?

Answer 11

Välj buffert som gynnar interaktion (pH, salthalt).
Eventuellt behövs tillsats, co-faktor.
Anpassa flödeshastighet så interaktion hinner med.

Question 12

Vad ska man tänka på för mobila fasen vid eluering?

Answer 12

Bryt interaktion bestämt men milt.
Undvik denaturering av målprotein & ligand.
Utmaning att se till att eluering fingerar men ej denaturera.

Question 13

Hur kan man eluera med pH?

Answer 13

Ändrat pH ger förändrad jonisering av laddade grupper hos ligand/protein.
Kemisk stabilitet hos matris, ligand, protein kan begränsa.
Vanligast metod (ofta pH 2-4).
Kan eluera ned i buffert som återställer pH för målprotein.

Question 14

Hur kan man eluera med jonstyrka?

Answer 14

Öka jonstyrka vilket bryter elektrostatiska bindningar. Behövs ofta 1 M NaCl.

Question 15

Vilka fem elueringsstrategier finns?

Answer 15

Denaturant/chaotrop.
Jonstyrka.
Kompetetiv eluering. 
pH.
Polaritet.

Question 16

Hur kan man eluera med polaritet?

Answer 16

Minskad polaritet kan störa hydrofoba interaktioner till ligand. Dioxane eller etylenglykol är milt mot proteinstruktur.

Question 17

Hur kan man eluera med kompetetiv eluering?

Answer 17

Man konkurrerar ut bindning till ligand med en annan som binder starkare. Konc. av konkurrenten ska matcha ligandmängden.

Question 18

Hur kan man eluera med denaturant/chaotrop?

Answer 18

Om inget annat fungerar använder man detta. Det förstör dock proteinstruktur och därmed interaktion till ligand. Ex. urea.

Question 19

Hur gör man CIP/regenerering på affinitetskromatografi?

Answer 19

Måste hitta balansgång mellan att rena och inte förstöra ligand, koppling…
Pulsning: bindnings/elueringsbuffert. Tvättar milt med något surt. Kort period med lågt pH, sedan högre, upprepa.
0.1 M NaOH tillsätts. Låga konc! annars förstörs matris.

Question 20

Pros & Cons med affinitetskromatografi?

Answer 20

\+ Hög specificitet, effektivt. 
\+ Få reningssteg behövs. 
\+ Rening & koncentrering i ett. 
- Känsliga ligander. 
- Dyra matriser. 
- Tuffa elueringsförhållanden. 
- Få tillgängliga ligander.

Question 21

Vad är affinitetstaggar?

Answer 21

Man kan fusera målprotein med tag för affinitetsrening.

Question 22

Vad finns det för fördelar/nackdelar med nativt målprotein utan tag?

Answer 22

+ Rening direkt av nativt målprotein, måste ej klyva bort tag sedan.
- Ligand måste finnas.

Question 23

Vilka fördelar/nackdelar finns med Genfusion (med tag)?

Answer 23

+ Generell metod för många målprotein.
+ Fusionssystem finns, etablerade protokoll.
- Reningstag kan störa.

Question 24

Vilka fördelar finns med tags?

Answer 24

Löslighetshöjande, hjälper protein att vara lösligt.
Specifik inbindning.
Detektion, hitta var protein är.
LSD!

Question 25

Vad är Mini-spidroin? Hur renar man?

Answer 25

Kan uttryckas i E. coli.
Fusera tag med proteinet så det hålls lösligt under rening. Tillsätt även His-tag.
Tags klipps bort och protein blir spindeltråd igen.

Question 26

Vilken roll har proteaser?

Answer 26

Klipper vid specifika aa-sekvenser.

Ex. proteas 3C - väldigt selektiv.

Question 27

Vad är Z-tag?

Answer 27

Binder till konstant del på antikroppar.

Eluering kräver lågt pH.

Question 28

Vad är C-tag?

Answer 28

Kort peptid (4-8 aa).
Känns igen av viss antikropp.
Inbindning beroende av kalcium.
Eluera genom tillsats av EDTA som avlägsnar kalcium.

Question 29

Vad är IMAC?

Answer 29

Immobilized metal ion affinity chromatography.
Metalljoner är ligand som fästs på matris via chelator. Vissa aa binder till metalljoner och måste vara exponerade för att kunna binda in.

Question 30

Hur minskar man jon-jon interaktioner i IMAC?

Answer 30

Minskas genom att tillsätta salt så att metaller ej binder pga sina jonegenskaper utan pga metallinteraktioner. De som endast binder pga jon kommer då binda med saltet istället. Vi minskar då vår ospecifika bindning.