Föreläsning 5 Flashcards
Affinitet
Vilka reningsprinciper är baserade på affinitet?
Bindningsyta, kolhydrater och metallbindande.
Vad händer om passformen förstörs?
Interaktionerna bryts och affiniteten minskar.
Beskriv affinitetskromatografi?
Egenskaper och krav.
Ofta selektiv.
Rening & konc. i samma steg.
Bindning måste vara reversibel. Bör även vara stark bindning.
Bra som tidigt reningssteg, men ej första. Pga dyra, känsliga matriser.
Vilket steg i CIPP är ofta affinitetsbaserat?
Intermediate Purification.
Vilka faktorer bör beaktas vid affinitetskromatografi?
Val av matris.
Val av ligand.
Ligandtäthet (kan ej vara för tätt mellan ligand & matris ifall målprotein är stort, måste ha bra avstånd mellan ligander).
Rätt förhållanden för inbindning.
Buffert där ligand & målprotein håller struktur.
Hur ska matrisen vara för affinitetskromatografi?
Minimal ospecifik interaktion. Makroporös, stor yta, många molekyler kan passera. Tåliga mot höga flöden. Stabila under reningsförhållanden. Aktiva grupper där ligand kan kopplas.
Hur ska liganderna vara för affinitetskromatografi?
Affinitet nog att fånga målprotein. Hög specificitet. Reversibel bindning. Stabilitet under reningsförhållanden. Möjlighet att fästa på matris.
Gruppspecifika ligander:
Protein A/G - Antikroppar.
Heparin - koagulationsprotein, enzym, tillväxtfaktor.
Lectiner - protein med glykosylering.
DNA - DNA-bindande protein
Ligandexempel:
Substrat/inhibitor - enzym.
Antikropp - antigen/cell/virus.
Hormon/vitamin - receptorer.
Komplementära baser - nukleinsyror.
Vad används spacer för? Vad är det?
Ofta kolkedja på 6-10 kolatomer.
Används för att få ut ligand från matriskulan.
Vad ska man tänka på för mobila fasen vid inbindning?
Välj buffert som gynnar interaktion (pH, salthalt).
Eventuellt behövs tillsats, co-faktor.
Anpassa flödeshastighet så interaktion hinner med.
Vad ska man tänka på för mobila fasen vid eluering?
Bryt interaktion bestämt men milt.
Undvik denaturering av målprotein & ligand.
Utmaning att se till att eluering fingerar men ej denaturera.
Hur kan man eluera med pH?
Ändrat pH ger förändrad jonisering av laddade grupper hos ligand/protein.
Kemisk stabilitet hos matris, ligand, protein kan begränsa.
Vanligast metod (ofta pH 2-4).
Kan eluera ned i buffert som återställer pH för målprotein.
Hur kan man eluera med jonstyrka?
Öka jonstyrka vilket bryter elektrostatiska bindningar. Behövs ofta 1 M NaCl.
Vilka fem elueringsstrategier finns?
Denaturant/chaotrop. Jonstyrka. Kompetetiv eluering. pH. Polaritet.
Hur kan man eluera med polaritet?
Minskad polaritet kan störa hydrofoba interaktioner till ligand. Dioxane eller etylenglykol är milt mot proteinstruktur.
Hur kan man eluera med kompetetiv eluering?
Man konkurrerar ut bindning till ligand med en annan som binder starkare. Konc. av konkurrenten ska matcha ligandmängden.
Hur kan man eluera med denaturant/chaotrop?
Om inget annat fungerar använder man detta. Det förstör dock proteinstruktur och därmed interaktion till ligand. Ex. urea.
Hur gör man CIP/regenerering på affinitetskromatografi?
Måste hitta balansgång mellan att rena och inte förstöra ligand, koppling…
Pulsning: bindnings/elueringsbuffert. Tvättar milt med något surt. Kort period med lågt pH, sedan högre, upprepa.
0.1 M NaOH tillsätts. Låga konc! annars förstörs matris.
Pros & Cons med affinitetskromatografi?
\+ Hög specificitet, effektivt. \+ Få reningssteg behövs. \+ Rening & koncentrering i ett. - Känsliga ligander. - Dyra matriser. - Tuffa elueringsförhållanden. - Få tillgängliga ligander.
Vad är affinitetstaggar?
Man kan fusera målprotein med tag för affinitetsrening.
Vad finns det för fördelar/nackdelar med nativt målprotein utan tag?
+ Rening direkt av nativt målprotein, måste ej klyva bort tag sedan.
- Ligand måste finnas.
Vilka fördelar/nackdelar finns med Genfusion (med tag)?
+ Generell metod för många målprotein.
+ Fusionssystem finns, etablerade protokoll.
- Reningstag kan störa.
Vilka fördelar finns med tags?
Löslighetshöjande, hjälper protein att vara lösligt.
Specifik inbindning.
Detektion, hitta var protein är.
LSD!
Vad är Mini-spidroin? Hur renar man?
Kan uttryckas i E. coli.
Fusera tag med proteinet så det hålls lösligt under rening. Tillsätt även His-tag.
Tags klipps bort och protein blir spindeltråd igen.
Vilken roll har proteaser?
Klipper vid specifika aa-sekvenser.
Ex. proteas 3C - väldigt selektiv.
Vad är Z-tag?
Binder till konstant del på antikroppar.
Eluering kräver lågt pH.
Vad är C-tag?
Kort peptid (4-8 aa).
Känns igen av viss antikropp.
Inbindning beroende av kalcium.
Eluera genom tillsats av EDTA som avlägsnar kalcium.
Vad är IMAC?
Immobilized metal ion affinity chromatography.
Metalljoner är ligand som fästs på matris via chelator. Vissa aa binder till metalljoner och måste vara exponerade för att kunna binda in.
Hur minskar man jon-jon interaktioner i IMAC?
Minskas genom att tillsätta salt så att metaller ej binder pga sina jonegenskaper utan pga metallinteraktioner. De som endast binder pga jon kommer då binda med saltet istället. Vi minskar då vår ospecifika bindning.
