Föreläsning 3

Question 1

Vad kan man använda kromatografi för?

Answer 1

Separation = dela upp protein i sitt prov i grupper/ämnen.
Identifiera = kräver referenssubstanser. 
Kvantifiera = kräver referenssubstanser. 

Brett användningsområde!!

Question 2

Vilka två faser ingår i kromatografi?

Answer 2

Mobil fas = rör sig & fraktar alla analyter (ämnen, substanser).
Stationär fas = kan vara partiklar ex. som analyter ska interagera med.

Question 3

Vilka tre huvudtyper av kromatografi finns?

Answer 3

Vätskekromatografi = mobilfas vätska.
Gaskromatografi = mobilfas är gas.
SFC (superkritisk vätskekromatografi) = mobilfas är superkritisk vätska (ex. CO2, ammoniak). Miljövänligt.

Question 4

Vad kan avläsas från ett kromatogram?

Answer 4

Man kan se om ämnen separerats och om separation bör förbättras. Topparnas storlek relaterar till mängd. Man kan dock ej jämföra toppar för olika ämnen.
Man kan identifiera ämnen genom att jmf kromatogram av kända ämnen.

Question 5

Vad är Tm (t0)?

Answer 5

Tm (t0) är dödtid, tiden det tar för ämne som inte alls interagera med SF utan endast åker med MF. Vet då exakt tid för injektion & detektion.

Question 6

Hur vet man om två ämnen kan separeras?

Answer 6

Injektionen kommer att fördela sig mellan SF och MF.
Man kan beräkna fördelningskonstanten K genom att dividera konc. i SF med konc. i MF.
Om K > 0 kan separation ske.

Question 7

Vad är retentionstid?

Vad kan man använda denna tid till att räkna ut?

Answer 7

Retentionstiden är tiden det tar för ämnet att passera igenom kolonnen (SF). Ju längre retentionstid, desto mer lika är ämnet och SF i polaritet.
Har man 2 ämnen varav ena har dödtid & andra retentionstid kan man räkna ut hur snabbt en retarderad analyt går igenom och en oreagerad analyts tid att gå igenom.

Question 8

Vilken upplösning vill man ha och hur beräknas den?

Answer 8

Upplösning på 1,5 är bra!

R = skillnad i retentionstid /medelvärde av topparnas bredd.

Question 9

Vad beror upplösning på?

Answer 9

Selektivitet (alfa) = LITEN ändring spelar STOR roll för upplösning. Tänk på det vid planering.
Effektivitet (N) = antalet bottnar. Påverkar med roten ur. Måste alltså öka mycket för att påverka.
Retentionsfaktor (k’) = vill hålla denna mellan 2-10. Har man ökning till värden över detta påverkas ej R.

Question 10

Hur beräknar man retentionsfaktor?

Vad påverkar detta?

Answer 10

k’ = (retentionstid - tid i mobilfas)/tid i mobilfas

Påverkas av mobilfassammansättning, stationärfasens typ och temperatur (MST).

Question 11

Hur kan man påverka selektivitet?

Answer 11

Genom att ändra mobilfasens sammansättning/typ. Ändra kolonnens temperatur. Viktigaste påverkan har stationärfasens typ. Specifika kemiska interaktioner.

Question 12

Vilken toppform vill man ha? Vad innebär toppformen?

Answer 12

Toppformen innebär effektivitet. Man vill ha så smala toppar som möjligt för bra upplösning. Ju bredare en topp blir desto sämre bottental.

Question 13

Hur beräknas effektivitet?

Answer 13

N = 16* (tr/wb)^2

Question 14

Vad vill man ha för värde på N?

Answer 14

Högt. 1000 är ganska lågt ex.

Question 15

Vilka faktorer påverkar bandbreddning?

Answer 15

Eddy diffusion = bandbreddning pga packningsojämnheter.
Diffusion = sker vid för låg hastighet.
Motstånd mot masstransport = sker vid för hög hastighet.
Dessa ska undvikas!!!

Question 16

Vad är Van-Deemter kurvan?

Answer 16

Den visar var man får bäst effektivitet för att minska eddy diffusion, diffusion, motstånd mot masstransport. Måste ha balans på hastighet.

Question 17

Vilka två faktorer ska optimeras för att ge bästa möjliga separation?

Answer 17

Effektivitet och selektivitet.

Question 18

Vad innebär kvantitativ analys?

Answer 18

Integration av topparea. Alla ämnen har olika responsfaktorer, vilka bestäms genom injektion av kända mängder & ställa upp responskurvor.
%A = ((ytan av A/retentionsfaktor av A)/(totala ytan/retentionsfaktor))x100

Question 19

För vilka molekyler används HPLC?

Answer 19

Används för lite större molekyler som är laddade, svårflyktiga och hydrofila.

Question 20

Vilka fördelar finns med HPLC?

Answer 20

Snabb analys, hög upplösning, känslig analysmetod, lämplig för preparativt arbete & produktionsskala, inga begränsningar pga flyktiga molekyler då man använder svårflyktiga.

Question 21

Vad är LLC?

Vilka två varianter på LLC finns det?

Answer 21

Liquid-liquid chromatography. 
Har inert (oreaktiv m. omgivning) porös massa som silica impregnerad med den stationära massan. Får ej lösa sig i mobilfas. 
Normal phase = mf är poplär och sf är polär. Polära ämnen adsorberas hårdare & elueras m. lösningsmedel av tilltagande polaritet. Interaktion kan bli för stark och då fastnar injektion på sf. 
Reverse phase = mf (polär), sf (opolär). Opolära ämnen fäster hårdare och elueras m. lösningsmedel av sjunkande polaritet.

Question 22

Vad är LSC?

Answer 22

Liquid-solid chromatography. Adsorptionskromatografi där ex. silikagel, aktivt kol kan användas.

Question 23

Vad är jonbyteskromatografi?

Answer 23

Ofta används det för starkt joniserande substanser.
Motjon tillsätts sf och bildar neutralt par. Separation sker i reversed-phase system. Målmolekylen kommer att byta plats med motjon.

Question 24

Vad är katjonbytare/anjonbytare?

Answer 24

Positiv binder in till katjonbytare och negativ till anjonbytare. (PANK = positiv anod, negativ katod).

Question 25

Vad är SEC?

Answer 25

Size Exclusion Chromatography. Sortera på storlek och ändra porstorlek beroende på molekyler.

Question 26

Vad är gradienteluering? När används det?

Answer 26

Om man vill föra samman föreningar med väldigt olika elueringstid till ett kromatogram så analysen ej tar för länge använder man detta.
MF-sammansättning förändras mellan det opolära & mindre opolära lösningsmedlet under analysen.
Mål är smala toppar som är baslinjeseparerade.

Question 27

Vad är isokratisk eluering? När används detta?

Answer 27

Samma MF-sammansättning under hela analysen.
Bra om man vill separera föreningar som är lika varandra i retentionstid.
De elueras vid olika retentionstid så det blir stor skillnad mellan.

Question 28

Vilka önskemål finns hos en HPLC-detektor?

Answer 28

Känslig, kort responstid, linjär, lika känslig för alla ämnen, liten detektorvolym, icke-destruktiv, robust, pålitlig.