Föreläsning 4

Question 1

Vad är SEC & vad baseras det på?

Answer 1

Size Exclusion Chromatography. Separation med avseende på storlek & form. Ingen fysisk separation, baseras endast på att molekyler tar olika vägar genom matrisen beroende på storlek & form.

Question 2

Hur ska matrisen vara för SEC?

Vad kan man tillsätta matrisen?

Answer 2

Man vill ha en matris av kulor med porer så att vissa molekyler går in i kulorna och vissa går runt.
Matrisen ska EJ gynna inbindning av protein, ska endast åka igenom.
Matrisen kläs med OH-grupper för att få hydrofilt så vatten kan pumpas igenom.

Question 3

På vilket sätt påverkar bufferten SEC?

Answer 3

Bufferten påverkar EJ separationen.

Question 4

Vilken påladdningsvolym vill man ha vid SEC?

Answer 4

Liten volym, är volymen för stor startar molekylerna ej samtidigt och separationen kommer ej stämma.

Question 5

Hur kommer kromatogram för SEC att se ut?

Answer 5

Större molekyler som går runt kulor kommer ut efter ca 1/3 av volymen av kolonnen (void volym, v0).
Mindre som går in i kulorna kommer ut efter ca 2/3 av volymen (vi).
Elueringsvolym/retentionsvolym (ve, vR) är volymen det tar innan det man söker kommer ut.

Question 6

Vad är distributionskoefficienten?

Answer 6

Distributionskoefficienten kD säger om man kan separera. Måste ha nog stor skillnad på värdena.
Kd = (Vr-V0)/Vi
Vi = vt-v0-vmatrix = por-volym.

Question 7

Vad är exclusional limit?

Answer 7

Minsta storlek som INTE kommer in i porerna. Dessa molekyler går runt kulorna och kan ej separeras.

Question 8

Vad är fractionation rate?

Answer 8

Storlekar som går in i porer.

Question 9

Vad är inclusion limit?

Answer 9

Största som går in i alla porer går ej att separera från de mindre som också går in i porer.

Question 10

Hur påverkar molekylernas form separationen (SEC)?

Answer 10

Den hydrodynamiska radien beror av form. En avlång molekyl tar upp mer plats vid rörelse och verkar som en större molekyl pga sin form. Separationen påverkas alltså inte bara av storleken utan även av formen.

Question 11

Vilka användningsområden finns för SEC?

Answer 11

Fraktionering av protein (separation).
Buffertbyte (större än saltmolekyler i buffert kan separeras bort).
Analys av storlek.

Question 12

Vad är fraktionering?

Answer 12

Separation, främst av stora kontaminanter i void. Kräver liten startvolym, anpassa & ha bred kolonn. Ladda provvolym 1-5% av kolonnvolym.

Question 13

Vilken storleksskillnad kräver fraktionering?

Answer 13

Ca 30%.

Question 14

Varför är fraktionering (SEC) inte bra som ett första reningssteg?

Answer 14

För att man har mycket volym i början och det klarar SEC inte av. Efter vt kan man dock ladda nytt, kör så långt att nya volymen ej hinner ikapp gamla.

Question 15

Hur fungerar avsaltning/buffertbyte mha SEC?

Answer 15

Små molekyler som salter fastnar i mikroporer i matrisen. Större som protein passerar mellan och elueras snabbare. Man laddar provvolym 30% av kolonnvolym. Kan ske mha gravitation, flöde eller centrifugering.

Question 16

Hur fungerar analys av storlek mha SEC?

Answer 16

Kalibrera kromatogram med molekyler av liknande storlek, ladda på prov och kolla likheter.
OBS. De kan ha samma storlek men olika form!

Question 17

Vad är unikt med SEC?

Answer 17

• Lägst upplösning.
• Lägst kapacitet.
• Späder ut prov.
  + Separerar multimerer (går ej via annat pga samma laddning etc.).
  + Separerar aggregat.

Question 18

Vad är jonbyte?

Answer 18

Har matris med laddningar, omgiven av motjoner från buffert. Proteiner med motsatt laddning till matris byter plats med motjoner.

Question 19

Hur eluerar man från jonbyte?

Answer 19

Svagt laddade molekyler tvättas bort med motionerna men de starka binder och elueras sedan med mycket motioner.

Question 20

Hur återställer man matris vid jonbyte?

Answer 20

Med lagom mycket motjoner.

Question 21

Vad kan påverka laddningen under jonbyte?

Answer 21

Omgivningen, hur mycket H+ det finns i buffert ex.

Question 22

Vad är pI?

Hur påverkar detta proteiner?

Answer 22

Isoelektrisk punkt, där nettoladdningen är noll. Antal plus = antal minus.
Basiska är mest positiva vid högt pH (ovanligt med pI>9).
Sura är med negativa vid lågt pH (ovanligt med pI<5).
Sura proteiner är vanligast och de har pI under 7.

Question 23

Hur väljer man jonbytare?

Answer 23

Beror av proteinets laddning i vald buffert.
Tänk på proteinstabilitet.
pH i omgivning, vill ha pH där protein kan interagera med katjon/anjonbytare.
Kontaminanter ska EJ binda in.
Vid lågt pH har man mycket H+, vid högt har man mycket OH-.

Question 24

Hur kan man härleda vilken laddning protein får baserat på dess pI och omgivnings pH?

Answer 24

Över pI vid högt pH = neg.

Under pI vid lågt pH = pos.

Question 25

Vad är Donnan-effekten?

Answer 25

Närmast matrisen där motjonerna befinner sig blir pH märkligt. Kan störa rening. Motjonerna repellerar varandra och bildar diffusa lager. Man måste se till att känsliga protein ej påverkas av detta och veckas fel pga pH-skillnaden.

Question 26

Vad är starka resp. svaga jonbytare?

Answer 26

Starka jonbytare är joniserade över ett brett pH-intervall och svaga är joniserade i smalt pH-intervall.
OBS. Ej att de binder in starkare/svagare!

Question 27

Hur eluerar man vid jonbyte?

Två metoder. Fördelar, nackdelar?

Answer 27

Salt kan användas men får ej vara buffrande ex. NaCl. Ger ok upplösning. Vanligast.
pH kan användas men är svårt att få stabil gradient. Risk att fälla protein nära dess pI. Ger dock högre upplösning och kromatofokusering.

Question 28

Vad är kromatofokusering?

Vilka krav finns på buffert och matris?

Answer 28

Jonbytare som elueras med pH-förändring. Speciell buffert behövs för stabil & långsam ändring. Matrisen måste vara laddad över hela pH-intervallet och hålla jämn laddning. Dock svårt pga donnan-effekten.
Kan ge superbra upplösning om man får till kraven.

Question 29

När är kromatofokusering extra bra?

Answer 29

Bra vid analyser!

Question 30

Vad är isokratisk eluering?

Ge ett ex. på en metod som använder detta.

Answer 30

En och samma buffert. Bygger på matrisinteraktion = irreversibel. Analyter blir olika retarderade av inbindning. Liten provvolym. Ex. SEC.

Question 31

Vad är gradienteluering?

Answer 31

Vanligast. Kontinuerlig förändring av buffert. Mängd salt ökar gradvis. Molekyler elueras gradvis.

Question 32

Vad är stegvis eluering?

Answer 32

Ökar salthalt i steg. Bra om man känner till vid vilken salthalt ämnen lossnar.

Question 33

Vilka för- och nackdelar finns med jonbyte.

Answer 33

\+ Lätt att utföra
\+ Stabila matriser
\+ Hög kapacitet 
\+ Mild eluering
\+ Bra upplösning
- Måste optimeras för alla protein
- Låg selektivitet

Question 34

Vad är reningstaggar?

Answer 34

De adderas på protein och gör det enklare att fånga upp jmf med andra protein. Man sätter reningstag vid genen för målproteinet och får ett fusionsprotein.

Question 35

Vilka för- och nackdelar finns med taggar?

Answer 35

+ Hög selektivt
+ Färre reningssteg
+ Generellt reningsschema för olika målprotein
- Större protein att producera
- Ta bort tag efteråt
- Begränsat antal tags & ligander. Kanske ej passar.

Question 36

Vad innebär laddad reningstag?

Answer 36

Man kombinerar tag & jonbyte. Utgick från protein som är lätt att producera i E. coli (Z). Proteinet hade normalt pI. Utifrån Z skapas Zbasic (katjonbyte vid pH 9) och Zacid (anjonbyte vid pH 6).
Fusionsproteinet renas fram mha EBA och ett proteas som klyver vid tagen tas fram. Efter klippning har vi målprotein för sig och tag för sig. Den avkylda tagen och proteas fastnar i kolonn, målprotein åker ut.

Question 37

Vilka önskade egenskaper har vi för laddad reningstag?

Answer 37

Många laddningar & extremt pI för selektivitet.
Bra för produktion i E. coli.
Fuserbar med olika målprotein.

Question 38

Hur ska man göra när IB har bildats? Hur påverkar det tag?

Answer 38

Lös upp IB med denturerande ämnen. Tag bör alltså fungera under sådana förhållanden.

Question 39

Hur kan man återvecka sina protein? Två metoder?

Answer 39

Solid phase refolding = starta med oveckade protein som ska hitta rätt och vecka. Kan hålla isär protein genom att binda dem till matriser & låta vecka. Matris håller isär medan man minskar halten urea.
Dilution refolding kan användas men kräver mkt större volym.