Föreläsning 1 Flashcards
Intro, provprepp, mål & skala, analys
Vad är de tre stegen som används i förberedelse av ett biologiskt prov?
- Proteinkälla
- Disruption/extraktion
- Klarifiering
Vilka huvudkällor till protein finns det?
Naturliga källor (blod, vävnad, växter, mjölk).
Kemisk syntes.
Rekombinant produktion (bakterier, jäst, mammalieceller).
Fördelar/nackdelar med naturliga källor?
+ Får exakt rätt protein (veckning osv).
- Liten andel målprotein i startmaterial.
- Måste rena bort värdcellens egna protein om målproteinet ej sekreteras.
Fördelar/nackdelar med kemisk syntes?
+ Kan syntetisera mycket material.
- Begränsad storlek (50 aa).
- Kan veckas fel.
- Dyrt.
Fördelar/nackdelar med rekombinant produktion?
+ Kan producera stor mängd.
+ Möjliggör produktion av modifierade proteiner.
- Kan aggregera.
- Måste rena bort värdcellens egna protein om målproteinet ej sekreteras.
Vad innebär disruption & extraktion?
Man vill omvandla proteinkällan till en lösning att rena fram konstruktet ifrån. Är konstruktet intracellulärt måste cellen slås sönder. Är konstruktet sekreterare måste man sortera bort celler från den extracellulära lösningen.
Hur kan man extrahera protein från mammalieceller?
Intracellulärt har mammalieceller endast plasmamembran:
Frys/tining = från EtOH/torris till 37C.
Sonikering = ultraljud > 20 kHz.
Kemiskt = detergent som SDS kan lösa membran.
Sekreterat (ofta via rekombinant produktion):
Mild centrifugering/filtrering = samla protein i supernatant, celler i pellet. Vill ej lysera!
Hur kan man extrahera från vävnad & växter?
Mammalieceller omges av ECM, växter har cellvägg.
Blenders/homogenizers = material pressas genom hålrum alt. skärs itu. Manuellt är mildare, automatiskt är effektivare.
Grinding = mortlas/mals. Tillsätter kulor/sand för ökad effektivitet.
Hur kan man extrahera från jäst?
Svårt att lysera jästceller. Sekreterad produkt önskas.
Beadmills = kvarn som roterar celler och kulor snabbt med rotorblad. Bäst för större celler.
Pressar/tryckförändringar = exempelvis french press för liten skala, high pressure homogenizer för större skala.
Enzymatiskt/kemiskt = enzym med glukanasaktivitet. Toluen kan delvis lösa cell. Dock dyrt.
Hur kan man extrahera från bakterier med intracellulärt protein?
Sonikering. Pressar/tryck = french press, high pressure homogenizer eller cell bomb som använder kvävgas för att ändra tryck. Enzymatiska metoder: Lysozym löser peptidoglykan. (Billigt)! EDTA destabiliserar LPS hos G-. Detergent kan lösa upp cellmembran. DNAse minskar viskositet hos DNA.
Hur kan man extrahera från bakterier via sekretion?
Extraktion av periplasmatiska protein via osmotisk chock. Hög jonstyrka får vatten att diffundera och cellen lyserar. Endast det yttre membranet sprängs.
Extraktion av membranproteiner kan kräva SDS då de är hydrofoba.
Varför vill man ofta bara lysera det yttre membranet hos bakterier som sekreterar protein.
På grund av att cytoplasman innehåller 2000 olika protein och periplasman endast innehåller 100 olika protein. Det är enklare att separera sitt målprotein från dessa 100 än från fler.
Vad är viktigt att tänka på vid extraktion och disruption?
Att använda mild och snabb metod. Låg temperatur så att protein ej denatureras. Minska proteolys som bryter ned främmande protein och få bort kontaminanter.
Vad innebär klarifiering?
Målet med klarifiering är att separera den lösliga fraktionen från celldebris & annat olösligt som hela celler t.ex.
Vilka metoder kan användas för klarifiering?
Centrifugering, sedimentering = celldebris i pellet och lösligt protein i supernatant.
Filtrering = storleksexklusion med filter som sil.
Fällning = utnyttja ämnens olika löslighet i salthalt, pH, temp, etc.
Två-fas extraktion = utnyttja ämnens olika vilja att befinna sig i olika lösningsmedel.
