Föreläsning 2

Question 1

Beskriv upstream?

Answer 1

Upstream innebär isolering av cell-linje (så att det blir reproducerbart, man vet att det är samma protein, veckning…).
Cellbanking, odling av celler, skörd.
Odling sker på stegvis ökande skala (ta ampull från bio-bank, ympa i större & större reaktorer).

Question 2

Beskriv downstream?

Answer 2

Celldisruption/extraktion. Klarifiering. Rening. Polishing.

Använder ex. sonikering, tryck, filtrering, kromatografi.

Question 3

Hur stor andel av en kromatografikolonn fylls av matris?

Answer 3

Ca 90%.

Question 4

Vilka önskade egenskaper finns hos en matris?

Answer 4

Hydrofil (pga mobilfas ofta vattenbaserad).
Liten ospecifik inbindning av protein.
Stabil mot höga flöden & tryck.
Stabil mot extrema buffertar, ex. tvätt.
Möjlighet att addera funktionella grupper för riktad rening.
Kan processeras till olika format.

Question 5

Vilka parametrar påverkas av matrisen?

Answer 5

Flödesmotstånd, effektivitet, selektivitet, kapacitet (FESK).

Question 6

Vilka oorganiska material är vanliga som matris?

Answer 6

Silika, glas, hydroxyaparit.

Question 7

Vilka organiska material är vanliga som matris?

Answer 7

Syntetiska (polystyren, polyakrylamid).

Polysackarider (agrars, cellulosa, dextran).

Question 8

Vad är aerogel? Ge ex.

Answer 8

Har samma volym oberoende av vätskefas.

Ex. poröst glas, silika, polystyren.

Question 9

Vad är xerogel? Ge ex.

Answer 9

Sväller/krymper beroende av vätskefas.

Ex. sephadex, polyakrylamid.

Question 10

Varför är det viktigt att veta om matrisen är xerogel eller aerogel innan packning?

Answer 10

För att låta matrisen svälla innan packning så att kolonn ej spricker om det är xerogel.

Question 11

Hur mäter man kulstorlek i matrisen?

Answer 11

Mha mesh size. Storlek på hål i en sil där kulorna passerar mäter dess storlek.

Question 12

Vad har kulstorleken för effekt och hur väljer man storlek?

Answer 12

Stora kulor ger litet motstånd och låg effektivitet. Små kulor ger stort motstånd och hög effektivitet. Detta pga att små kulor ger ökad interaktion.
Man får avväga om man vill ha snabbast eller renast metod.

Question 13

Brukar man börja med stora eller små kulor? Varför?

Answer 13

Man brukar börja med stora kulor först och sedan minska. För att man i början har mycket mer volym och då är det bäst att ha stora. När man senare vill rena noggrannare tar man små.

Question 14

Vilka former av matriskulor finns det?

Answer 14

Solida beads = endast ytarea som interaktion, klarar mkt mottryck och går ej sönder.
Porösa layer beads = ökad ytarea, mer interaktion.
Mikroporösa = ännu mer ökad area “kanaler”.
Makroporösa = ännu mer, “kanaler”.

Question 15

Hur gör man porösa matriser mer stabila?

Answer 15

Genom korslänkning på molekylnivå. Ju kortare bindning, desto stabilare blir det.

Question 16

Varför kopplar man på ligander? Ge ex.

Answer 16

För att få specifik inbindning till en kemisk grupp för att gynna inbindning.
Ex. en grupp som binder metalljon eller något som binder ett specifikt protein.
Om man vill att vatten ska interagera kan man tillsätta något polärt.

Question 17

Vilka material på kolonner används för HPLC och FPLC? Hur ser en vanlig kolonn ut?

Answer 17

För HPLC används rostfritt stål så det klarar det höga trycket. För FPLC används glas eller plast.
En kolonn har ett filter i botten och ett i toppen. Förfiltret samlar upp smuts.
Dimensioner anpassas efter reningsmetod och provvolym. Baseras separation på storlek måste man ha en längre kolonn än vanligtvis.

Question 18

Vad ska man tänka på när man packar en matris? Mål?

Answer 18

Matrisen packas som utspädd slurry och en adapter kan användas för att lättare packa stora volymer. Vissa måste svälla innan.
Man vill ha jämn packning och flöde, lite mottryck, inget tryckfall, inga kanaler och inga luftbubblor.

Question 19

Vad är expanded bed adsorption?

Answer 19

Mha det slipper man klarifiera.
Man laddar kolonnen med mellanrum & kulor av varierande storlek utspridda över stor volym. Skräp kan passera igenom utan att logga igen. Flödesriktningen är UPPÅT. Skräp åker ut och protein binder in. Sedan vänds flödet och matriskulorna packas ihop. Proteiner kan elueras.

Question 20

Vilka önskade egenskaper hos bufferten har vi vid proteinrening?

Answer 20

Hydrofil, icke-toxiskt, hög buffertkapacitet, hög renhet, liten abs vid 280 nm, liten salteffekt/interaktion med andra komponenter, stabil (behöver ej göra ny varje dag), avlutad (vill ej ha luftbubblor).

Question 21

Vilken buffert är vanligast vid proteinrening? Varför?

Answer 21

Fosfatbuffert då den har pH 7. Samma pH som i kroppen som många protein är vana vid.

Question 22

Vilka vanliga tillsatser kan man ha i buffert? Varför tillsätter man dessa?

Answer 22

Syra/bas (för att påverka pH), salt (då protein är vana i viss salthalt), DTT (reducerar disulfidbryggor), Proteashämmare (så protein ej klipps sönder), Detergenter (minskar hydrofob interaktion), glycerol (gör tjockare, hjälper struktur), bakteriehämmande som natriumazid (hållbarhet ökar, dock ej nyttigt!).

Question 23

Vilka protein:matris interaktioner finns?

Answer 23

Joniska (dipol), vätebindningar, van der waals, pi-pi, kovalenta, hydrofoba interaktioner.

Question 24

Vilka separationsprinciper finns?

Answer 24

Storlek och form (SEC).
Laddningar (IEX).
Bindningsyta (affinity).
Kolhydrater (lectin affinity).
Hydrofobicitet (HIC, RPC).
Tioler (kovalent).
Metallbindande (IMAC).

Question 25

Hur planerar du ditt reningsschema?

Answer 25

Definiera målet (hur rent och vilken mängd?).
Beskriv målproteinet (laddning, storlek, specifika egenskaper, hur skiljer det sig från bakgrunden, under vilka förhållanden är det stabilt?).
Kartlägg kontaminanter (hur smutsigt/utspätt är startmaterialet, vad är viktigast att få bort först, proteaser ex?).

Question 26

Vad är CIPP?

Answer 26

Capture = isolera, koncentrera, stabilisera.
Intermediate Purification = ta bort bulkorenheter.
Polishing = uppnå final kvalitet, rätt buffert.

Question 27

Beskriv Capture-steget i CIPP?

Answer 27

Målet med Capture är initial rening från ett klarifierat prov. Man vill ha snabb isolering, stabilisering (minska proteaser ex.) & koncentrering (minska volym) av målprotein.
Man optimerar Capture genom speed & capacity. Använd makroporösa, stora kulor vilket ger ett högt flöde. Stor, tät yta ger hög inbindning.

Question 28

Beskriv Intermediate Purification-steget i CIPP?

Answer 28

Målet är att ta bort bulkorenheter.
Optimera genom capacity & resolution. Selektion sker genom adsorption & desorption. Kan använda gradient eller stegvis eluering.

Question 29

Beskriv Polishing-steget i CIPP?

Answer 29

Målet är att ha final renhetsgrad i rätt buffert.
Optimera genom resolution & recovery. Man vill få bort alla orenheter inkl. varianter av proteinet. Använd små, mikroporösa kulor vilket ger hög effektivitet.

Question 30

Vilka analyser brukar göras under reningsprocessen?

Answer 30

Konc. bestämning, koll av renhetsgrad, identifiera om det är rätt protein.

Question 31

Hur görs koncentrationsbestämning?

Answer 31

UV-absorption kan användas. Proteiner absorberar ljus vid 280 nm (främst genom aromatiska aa). Mät med spektrofotometer & räkna ut konc. med Beer-lamberts lag. A = Elc.

Question 32

Vad är SDS-PAGE? Vad används det för?

Answer 32

SDS är en molekyl som tillsätts proteinet för att denaturera det och ge det en negativ laddning. Separationen kan då baseras endast på storleken. Metoden ger snabb koll av renhetsgrad och identitet av protein. Färga sedan in.

Question 33

Ge ex. på en färg som används vid SDS-PAGE.

Answer 33

Ex. Coomassie Brilliant Blue som binder till protein i sura lösningar. Vid inbindning går den från brun till blå.
Kan även använda Silver Staining eller Fluorescent dyes.

Question 34

Vilket efterarbete krävs efter kromatografi?

Answer 34

Ta hand om kolonn, matris, instrument. Cleaning in place och regenerering av matris.
Ta hand om protein. Rätt konc, buffert och förvaring.

Question 35

Vad innebär CIP?

Answer 35

CIP är Cleaning in Place och tvättar bort orenheter från matris och kolonn mha ex. salt, lut och syra. Man vill undvika tillväxt av mikroorg. Justera tvättningen efter matristålighet. Jonbytare tål mer än affinitetsmatriser till exempel.

Question 36

Vad innebär regenerering?

Ge ex. för olika kromatografer.

Answer 36

Regenerering återställer matris till förhållanden som gynnar inbindning.
Ex. behövs rätt pH & salthalt för jonbytare.
Ex. metalljoner för IMAC.
Ex. rätt pH för affinitets.

Question 37

Hur kan man öka konc. av proteinet och minska volym?

Answer 37

Fällning (för tåligare protein) = fäll, centrifugera och lös upp i mindre volym. Finns dock risk för denaturering.
Ultrafiltrering = membran separerar stora molekyler från buffert.
Osmos.

Question 38

Hur kan man byta buffert?

Answer 38

Diafiltrering = upprepa ultrafiltrering för att få bort buffert och späd protein i ny buffert.
Buffertjustering = om buffert ej helt behöver bytas ut (ex. ändra pH, tillsätta något).
Dialys = späds ut genom jämnvikt. Endast protein kvar i “korven” och får kan tillsätta ny buffert.
Gelfiltrering.

Question 39

Hur kan man behandla en biomolekyl om den ska hålla för längre transporter?

Answer 39

Genom frystorkning. Låter buffert avdunsta vid låg temp. Fryser proteinet och minskar tryck så sublimering sker. OBS. buffertsalterna finns kvar. Dock ganska krångligt för proteiner.