Quiz 5 Flashcards
Definicion microarreglos
Metodología que permite la identificación de moléculas de ADN o ARN mediante hibridación en una estructura de vidrio o silicona
Los microarreglos permiten la lectura de …
Miles de variantes en un solo ensayo
Principio de complementaridad de los microarreglos
Hibridación de ácidos nucleicos
De cuantos fragmentos es la secuencia de oligos (microarreglos) ?
15 a 25 nt
Como se detectan los microarreglos?
Fluorescencia (BN marcadas)
(Los oligos son fluoroforos)
En los microarreglos, mientras más presente este =
más fluorescente
Microarreglo ADN
- SNPs
- 1nt x celda con oligo
Microarreglo de ARN
- Analisis de expresion genica
- Enfermos vs sanos
- Identifica ruta metabólica
Que se analiza en el microarreglo de ARN?
El cDNA (porque el RNA es muy inestable)
Con que microarreglo piensas en polimorfismos específicos?
ADN
Usos del microarreglo ADN
- Forense (amplificación de SNPs)
- Ciencias de la salud (enf metabólicas)
Usos microarreglo de ARN
- Ciencias de la salud (comparación enfermos vs sanos)
- Microbiología (resistencia bacteriana)
Que es la metilación de ADN?
Transferencia de grupos metilo en el carbono 5 de la citocina presentes en las islas CpG
En los microarreglos de metilación, como sabes si esta metilada?
Cambia CpG por un uracilo.
Lo identificas en el software
En los microarreglos de metilación, quien hace el marcaje para saber que no esta metilado?
Los bisulfitos (detectan las regiones no metiladas, cambian C por una T y sale color rojo)
En los microarreglos de metilación, de que color sale cuando si esta metilado?
Verde
(Marca ACG)
Que significa PCR
Reacción de cadena de polimerasa
Quien invento la PCR?
Kary Mullis (1983)
PCR convencional
- Amplifica una región genética específica
- Gel de agarosa o acrilamida
PCR cualitativo
- Identifica presencia o ausencia de un fragmento especifico
- Diagnostico de infecciones
PCR semicuantitativo
- Niveles de expresión de un gen (ARNm)
- Biopsias
PCR cuantitativo
- Mide cuantos microorganismos o ARNm hay en un gen particular
- Curvas de referencia
PCR múltiple
- Amplificación de varias regiones génicas en una misma reacción de PCR
- Cada región cuenta con su pares de oligos
Cuales son las 3 etapas de la amplificacion en PCR?
- Desnaturalización
- Replicación
- Elongación
Componentes de la amplificación en PCR
- ADN
- Primers
- DNA pol
- dNTPs
- Magnesio (cofactor)
Funcion dNTPs
Ayudan a formar el enlace fosfodiester
Desnaturalización (amplificacion PCR)
- Separa las 2 cadenas
- 95°C, 5 min
Cuantas veces se repiten los ciclos de amplificación? En PCR
35 veces
Cual es el otro nombre de la PCR en tiempo real?
Cuantitativa
Detección de PCR en tiempo real.
SYBER green
- Cuantificación y expresión
- Elemento intercalante
- Ubica el cDNA
Detección de PCR en tiempo real.
TaqMan
- Más especifica
- Sonda Probe
- Necesita un primer para delimitar lo que quieres marcar
- Detecta SNPs
Que contiene la sonda Probe?
- Apagador/Quencher ( Q )
- Fluoroforo ( R )
Ventajas PCR en tiempo real
- Ver eficiencia de la reacción
- Ver la curva de amplificación al momento de hacer la PCR
Que PCR se usa para COVID?
Tiempo real
Principal objetivo de la proteomica
Entender la expresión, función y regulación del conjunto completo de proteínas codificadas por un organismo
Técnicas para el estudio de las proteínas
- Electroforesis mono y bidimensional
- Espectrometria de masas
- Técnicas in silico
La purificación de proteínas se monitoriza mediante…
SDS-page (gel electroforesis monodimensional para separar las proteinas)
Electroforess bidimensional
Separación de proteínas por:
- Isoelectroenfoque (IEE) —> punto isoeléctrico (PI)
- Masa molecular
Para que sirve la espectometría de masas?
- Saber que a.a. tiene la proteína y si coincide la secuencia
- Huellas peptidicas
En la espectometría de masas, que hace la tripsina?
Muestras proteicas digeridas
Corta donde esta la arginina para identificar el a.a.
Huella peptídica (peptide mass fingerprint)
- Hay péptidos que son específicos en algunas proteínas —> identifica proteínas
- Usa espectometría de masas
- Relación masa/carga
Metodologías para evaluar interacción proteína-proteína
- Doble hibrído Y2H (yeast two hibrid screening)
- FRET (energía fluorescente transferida por resonancia)
Y2H
El factor de transcripción tiene dos partes:
- Dominios de unión a ADN
- Dominio de activación
Si si interactúan las proteínas, se unen los dominios y empieza la transcripción
FRET
- Para validar la interacción
- Tiempo real
- Microscópico
Fluoroforos:
- Donadores
- Aceptor: emite la luz amarilla
En FRET, CFP se excita a _____nm; emite ____nm (azul)
436nm
480nm
Luz azul significa que no hay interacción
Como saber si hubo interaccion entre proteínas con Y2H?
YFP se excita a 480nm, y emite una luz amarilla (535 nm)
Western blot
- Técnica de detección de proteínas
- Unión anticuerpo proteína mediante un marcador radioactivo
- Se ve la imagen de la proteína cuando fluoresce
Modificaciones postraduccionales
- Fosforilación
- Acetilación
- Metilación
- Acilación
- Ubiquitinación
Fosforilación
Activación/desactivación de actividad enzimática
Acetilación
- Estabilidad de proteínas
- Regulación de la interacción proteínas-DNA (histonas)
Metilación
Regulación de la transcripción
Acilación
Modificación de lipidos
- Localización
- Anclaje de membrana
Ubiquitinación
Señal para degradación de proteínas
Métodos de separación de organelos
- Inmunofluoresencia
- Fraccionamiento bioquímico —> detergentes
Definición biomarcadores
Marcadores que se pueden utilizar en medicina para la detección precoz, el diágnostico, la estadificación o el pronóstico de enfermedades
Los marcadores (biomarcadores) pueden ser:
- Metabolitos
- Péptidos proteinas
- Medidas de propiedades físicas (ej: la presión arterial)
MALDI-TOF
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight
Uso de MALDI-TOF
- Moléculas grandes
- Identificación de cepas bacterianas y fúngicas mediante masa/carga
- Diagnóstico
Técnicas de identificación de modificaciones postraduccionales
- Western-Blot
- ELISAS
- Espectometrías de masas
Convenciones internacionales para normas y regulaciones éticas
- UNESCO
- GDPR
Principios básicos de la amplificación en PCR
- Complementaridad
- Dirección 5’ —> 3’ (requiere que el extremo 3’ este libre)
Ciclos de amplificación de PCR
- Temperatura de desnaturalización (95°C, 30 seg)
- Temperatura de alineamiento (59-60°C, 30-40 seg)
- Temperatura de extensión (72°C)
