Praktikum VL5 + VL6: Transformation

Question 1

DNA Isolierung: zelllysis

Answer 1

1. 1 Tropfen zellsuspension abnehmen
2. Zum Rest 0,2 ml lysozym, 30min bei 37°C
3. 1 Tropfen wird mikroskopiert
4. Zugabe von 0,4ml natriumdodecylsulfat-lösung (25%)
5. Vorsichtig schwenken bei 45°C
6. Zelllysat-probe mikroskopieren

Question 2

Wirkung vom lysozym

Answer 2

Abbau der zellwand
Wassereintritt in Zelle
Plätzen der Zelle

Question 3

DNA Isolierung: Abtrennung von Proteinen und lipiden

Answer 3

8. Zugabe von 1,7ml NaCl-lösung (30%), Schwenken
9. Zugabe von 0,1ml Natriumdesoxycholat-lösung (25%), schwenken 15min RT
10. Zentrifugation 15min, 20°C, 4000 Upm
11. Überstand in neues röhrchen
12. Zugabe von 5ml Chloroform-Octanol (5:1), 5min schwenken
13. Zentrifugation 15min,20°C 4000 Upm
14. Überstand (wässrig Phase in neues röhrchen

Question 4

Vorgehen bei Isolierung von genomischen DNA aus B. subtiles QB4238

Answer 4

1. Zelllysis
2. Abtrennung von Proteinen und lipiden
3. Fällung der DNA
4. Extraktion der DNA

Question 5

DNA Isolierung: fällung der DNA und Extraktion

Answer 5

Zur wässrigen Phase Zugabe des doppelten Volumens ethanol (96%, eiskalt)
-> fällung
Mit Stäbchen rühren
DNA aufwickeln

Question 6

Zellwände der archaea

Answer 6

• kein Peptidoglykan
• s-layer
• andere polysaccharide
• pseudomurein
• glykosiliertes polyglutamat

Question 7

Hauptfunktion der Cytoplasmamembran

Answer 7

1. Permeabilitätsbarriere
2. Selektiver Transport, chemotaxis (durch Membranproteine)
3. Energiekonservierung

Question 8

Chemische Bindung bei lipiden

Answer 8

Esterbindung: bacteria, eukarya

Etherbindung/ isopropeneinheit: Archaea

Question 9

Struktur der LPS (lipopolysaccharid)

Answer 9

= Endotoxin

O spezifische polysaccharidkette

Kern polysaccharid

Lipid A

Question 10

Struktur der zellwand

Answer 10

Peptidoglykan/ murein = heteropolymer aus ketten von N-Acetyl-Glucosamin und N-Acetyl-Muraminsäure
Verknüpft durch beta-1,4-glycosine

Question 11

Typische Muramin AS

Answer 11

L/D-alain
D-Glutaminsäure
m-Diaminopimelinsäure
L-Lysin

Question 12

Vorgehen bei der Übertragung der Kanamycin Resistenz durch Transformation

Answer 12

B. subtilis wird auf Agar mit Kanamycin ausgestrichen

DNA aus Km^R Zellen wird hinzugefügt

Wachstum von transformanten (rekombinanten)

Question 13

Natürliche Kompetenz

Answer 13

• physiologischer zustand, in dem DNA effizient aufgenommen werden kann
• B. subtilis: bei Übertragung in stationärer Phase, ausgelöst durch nährstofflimitation, zelldichte, vor sporulation
• nur dsDNA bindet
• recombination nur innerhalb verwandter Arten
• DNA für Reparatur endogener Schäden
• Erwerb neuer Eigenschaften
• DNA als nährstoffquelle

Question 14

Erzeugung künstlicher Kompetenz

Answer 14

Zb bei E. coli

• Behandlung mit eiskalter CaCl2-lösung
• Elektroporation

Question 15

Wachstumsphasen bei B. subtilis

Answer 15

Logarithmische Wachstum, symmetrische zellteilung

Mobilität, Rückführung von Nährstoffen, Antibiotika produktion

Kompetenz

Sporulation, asymmetrische zellteilung