Pochette brune Flashcards
Qu’est-ce que la transgénèse?
Introduction d’un gène étranger dans un génôme
Bases de séquence d’évènement d’une transgénèse
- Sélection du gène d’intérêt
- Clonage de ce gène dans un plasmide adéquat
- Transformation bactérienne pour amené le plasmide à la cellule visée
- Incorporation du gène étranger dans l’ADN
- Sélection des c. transformé + croissances
- L’organisme est totalement transgénique (toutes les ADN des c. ont le gène d’intérêt
Caractéristique de la rx de polymérisation en chaine
- Permet de produire une grande quantité copie a partir d’un séquence d’ADN précise
- ADN est dénaturé par haute T° pour avoir un brin monocaténaire
- Des amorces d’ADN sont synthétisées d’avance. Les 2 sont complémentaires à un des 2 brins d’ADN. Une amorce sens et une anti-sens
- L’ADN polymérase utilisé est résistante à de hautes T°
- Pls cycles dénaturation-hybridation-polymérisation sont requis pour effectuer une grande quantité de copie
Composantes de la PCR
- L’ADN matrice (le plus frais possible mmmmh dla bonne tope)
- Amorces en haute conc. p/r à l’ADN amplifier
- Enzymes (ADN polymérase)
- Tampon spécifique de l’enzyme (MgCl2, Mg est cofacteur de ADN pol)
- les 4 désoxyribonucléotides triphosphates(dNTP): dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
Les étapes de la réaction PCR
- Dénaturation: Hausse de la T° pour séparer l’ADN matrice en 2 brins monocaténaires
- Hybridation: Baisse de la T° pour lier amorce avec brins. Les amorces sont complémentaires à une partie de la séquence
- Élongation: Amorces deviennent extrémités 3’-OH, donc l’activité de l’ADN pol peut commencer
- Rx en chaine: Brins d’ADN nouvellement formé deviennent à leur tour l’ADN matrice
Amplicon def
Molécule finale délimitée par les amorces qui représente la majorité de l’ADN finale
Vitesse de la PCR
Au début c’est exponentielle, ensuite les réactifs viennent limités la rx se qui rend la vitesse linéaire. Ensuite atteinte d’un plateau car les réactifs sont épuisés.
Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction?
Endonucléase capable de reconnaitre une séquence spécifique (site de restriction) d’ADN et de couper l’ADN bicaténaires à cet endroit.
D’où proviennent les enzymes de restriction?
Des bactéries qui naturellement viennent éliminer/restreindre l’ADN étranger
Caractéristiques des sites de restrictions
- 4 à 8 nucléotides
- Plupart sont des palindromes
- Très courts, donc fortes chances d’être svt présent dans un génome
Type de coupures
Franche: extrémités double brins
Cohésive: extrémités libres simples brins
Caractéristique du clonage traditionnel
Les ligases peuvent catalyser l’insertion de fragments de restriction
Les coupures cohésives sont préférables
Pour 2 molécules d’ADN diff. qu’ont veut lier, on peut soit:
- Utiliser la même enzyme de restriction, lors de la ligation le site de restriction est reproduit
- Utiliser 2 enzymes diff., mais qui produisent de extrémités compatibles. Site de restriction pas produit
Explique la visualisation d’ADN sur gel d’agarose
- L’ADN est chargé négativement et est soumis à un champ électrique
- Il est déposé du côté négatif du gel et migre vers le côté positif
- Plus l’adn est petit plus il parcours une grande distance
- Pouvoir l’adn on utilise des composé comme le bromure d’éthidium qui s’installe entre les BA
Explique la cartographie de restriction
-Utiliser pour comparé la position prévue et réelle de site de restriction sur une séquence d’ADN connue
Même ADN = Même séquence = Même site de restriction au même endroit
Définition d’un vecteur en contexte de biomoléculaire
Mol. d’ADN circulaire susceptible de recevoir un segment d’ADN étranger pour ensuite le maintenir dans la c. hôte
Caractéristiques des plasmides utilisés en clonage
Possédent
- Origine de réplication
- Marqueur de sélection
- Site de multiclonage
Utilisation des plasmides en labo
- Enzyme de restriction produisent fragment d’ADN. Permet ouverture et préparation de l’ADN
- La ligase joint les fragments d’ADN. 3 possibilités
- Ligase joint le plasmide à la section du gêne d’intérêt. C’est l’ADN recombinant (celui qu’on garde et veut)
- Bcp de plasmides vont se refermer sur eux-même (plasmide non recombiné)
- Portions d’ADN comprenant gêne d’intérêt vont se refermer sur eux-mêmes (meurt) - on garde seulement les bactéries avec l’ADN recombiant
Caractéristiques des vecteurs plasmidiques de propagation
Réplique le vecteur en grande quantité dans la bactérie
- Amplifie et purifie un ADN particulier
- ADN recombinant et gêne d’intérêt inséré ne sont pas transcrit ou exprimés dan la c.
- Origine de réplication à haut rendement
Caractéristiques des vecteurs d’expressions
- A un promoteur actif et permet transcription de l’ADN recombinant
- Promoteur svt dérivé de l’organisme hôte et répond à la régulation génique
- Prod. de prot. ds notre espèce d’intérêt
- Permet l’ajout de marqueurs de sélection (svt des gènes de résistance à un antibiotique, permet d’enlever les bactéries qui n’ont pas l’ADN recombinant)
Qu’est-ce qu’un site de multiclonage?
Contient pls sites de restrictions pour l’insertion de fragment d’ADN
Explique la propagation d’un vecteur
Elle se fait par transformation: organisme récupère un ADN présent dans le milieu extracellulaire (compétence génétique).
Certains organismes n’ont pas cette compétence, il faut donc les rendre compétent.
-Gène de résistance du plasmide le fait résister le milieu sélectif
Qu’est-ce que le gène lacZ?
Enzyme présente sur le lactose et qui hydrolyse le X-Gal (donne une couleur bleutée)
Si la bactérie a un vecteur recombinant, elle va être blanche.
Différence entre transformation, transfection et transduction
Transformation: introduction d’un ADN étranger dans une c. procaryote
Transfection: introduction d’un ADN étranger dans une c. eucaryote
Transduction: Transfert d’ADN entre bactéries par des phages (virus)
Comment développer la compétence bactérienne?
Perturber la perméabilité sélective de la membrane plasmique pendant un court moment:
- C. dans une solution contenant des cations divalents
- Ensuite, incubées avec adn libre et exposées à un choc thermique/électrique (électroporation)
Type de transfection
Requiert l’utilisation de souches bactériennes et plasmides recombinés adéquats
- Transfection transitoire: ADN incorporé est indépendant du génome. Info génétique peut être exprimé pendant un certain, mais perdue et pas transmise par division cellulaire
- Transfection stable: Portion du plasmide s’intègre au génome. Transmise par division cellulaire.
- Incorporation ectopique: portion du plasmide s’intègre au hasard dans le génome
- Remplacement d’un gène: ADN recombinant est entouré de séquences précises qui permettent l’échange d’une partie du génome avec ADN recombinant.
Caractéristique de la transfection chez la plante
Utilisation du plasmide Ti et des bactéries Agrobacterium & rhizobium.
L’insert entouré de séquence permet l’incorporation du gène d’intérêt dans le génome.
C. végétales est cultivés pour former un nouvel individu.
Méthodes de transfection chez la plante
Transfection des gamètes: Fleurs soumises à la transfection et la prochaine génération va avoir l’ADN recombinant
Formation de cals: Sections de tissus sont soumis à la transfection. Ont fait une cultivation pour dédifférencier les c. Ont choisis les c. avec l’ADN recombinant (on utilise un marqueur de sélection)
Étapes de la transfection chez les animaux
- Culture de c. souches embryonnaires via culture de blastocytes
- Construction du vecteur avec des morceaux d’ADN homologues à l’ADN cible, en plus du gène à perturber et un gène de sélection
- Transfection c. embryonnaires par recombinaison homologue, séquence du génome est échangé avec elle du vecteur
- Prolifération des c. transformées et de sélection
- Injection des c. transformées dans un blastocyte
- Développement du mutant
Lors du séquençage d’une insertion dans un plasmide, où on place l’amorce?
Sur le plasmide, car s’il y a eu une contamination qui s’est rajouté sur notre vecteur, l’amorce pas tout simplement pas s’y lier, donc on peut voir s’il y a une erreur.
Dans quel sens les amorces permettent la polymérisation?
5’ vers 3’
