DÉVELOPPEMENT DE SOI Flashcards
Qu’est-ce que la morphogénèse?
Processus de dev des structure d’un organisme au cours de son embryogénèse
Truc à savoir sur l’homologie des séquences des espèces
Une grande partie de la machinerie fondamentale du dév est pratiquement la même chez les membres d’un embranchement des animaux
Les 4 manières de voir les gènes
Quel sont les 2 types de gènes qui sont exprimés par les différents types cellulaires?
Des gènes communs (housekeeping genes) et des gènes qui les rendent spécifiques
De qui proviennent les homologues?
d’un ancêtre commun
De quelle manière est-il possible de voir la diversité du transcriptome?
Par la banque d’ADN
Qu’est-ce qu’un trancriptome?
Ensemble des ARN issus de la transcription
De quoi est composé les banque d’ADN?
D’une population de vecteurs identiques qui contiennent chacun un insert différent
Quelle banque d’ADN représente tout le génome?
ADN génomique
Quelle banque d’ADN inclus les introns, les exons, les promoteurs, l’ADN répétitifs, etc?
ADN génomique
Quelle banque d’ADN permet de créer une image moléculaire de tous les ARNm exprimés dans un tissu ou à un stade de développement donné?
ADN complémentaire
Dans quelle banque d’ADN est-ce qu’on laisse tomber tout ce qui est introns, etc.?
ADN complémentaire
Quelles sont les principales étapes de création d’une banque d’ADN génomique?
- Extraction de l’ADNg à partir de n’importe quel tissu
- Fragmentation de l’ADN en séquence de tailles optimales
- Clonage ds un vecteur (plasmide): c’est létape de stockage
- Séquencage ou criblage ds banques
Quelles sont les principales étapes de création d’une banque d’ADN complémentaire?
- Extraction de l’ARNm à un moment précis
- Rétrotranscription en ADN complémentaire
- Clonage ds un vecteur(plasmide): c’est létape de stockage
- Séquencage /criblage des banques
Quelle est l’étape préalable à l’extraction de l’ADN génomique?
Isolation des noyaux par centrifugation (éviter contamination)
ADNg : Pas quelles méthodes est-ce qu’on peut digérer l’ADN?
- Enzyme de restriction
- Fragmentation (ADN explose suite à sonication ou forte pression)
Truc pertinent à savoir sur le criblage de banque d’ADN
- Séquencer banque compléte est trés couteux
- On va selectionner les clones qui nous intéressent avant de les séquencer
- Repose sur le principe d’hybridation des séquences
- Maintient à temp très froide entre les séquencages
- Utilise des puces à ADN
Que sont les séquences dégénérées?
Toutes les séquences possibles pour un gène (plusieurs codon pour même AA)
Nomme les 3 grandes stratégie favorisant la différenciation
- Localisation d’ARNm selon la polarité de l’œuf ou de l’embryon. (au lieu d’être répandu vont être conc. où c’est fécondé)
- Contacts entre cellules voisines ou sécrétion paracrine.
- Gradients moléculaires dictant des patrons de développement selon la position de la cellule.
Pourquoi la localisation d’ARNm est asymétrique?
C’est dû à l’asymétrie intrinsèque des éléments du cytosquelette
Qu’est-ce qu’une puce à ADN?
Arrangement ordonné, sur un support miniaturisé de verre, de silicium ou de polymère, de centaines ou de milliers de sondes moléculaires. Dans chaque petite case il y a un vecteur + une sonde. Sur une lame de microscope on peut voir tout le génome grâce aux puces
À quoi sert une puce d’ADN
Comparer les niveaux d’expression entre les tissus saints et malades
Les stratégies de différenciation permettent quoi?
- Commutateurs génétiques complexes
- Division asymétriques
Typiquement, quels molécules sont distribuée asymétriquement?
ARNm codant pour des activateurs ou des répresseurs de la transcription
Protéines
Et d’autres molécules
Asymétrique veut aussi dire taille de la cellule
Les ARNm codant pour des activateurs ou des répresseurs de la transcription sont amenés à destination grâce à?
interaction entre protéine adaptatrice et séquence de la région 3’UTR,
Avec quoi interagit la prot adaptatrices p/r à la localisation d’ARNm?
Avec la région 3’UTR de l’ARNm et des composantes du cytosquelette (filament d’actine et transportation par croissance du filament d’Actine)
Composition des banques d’ADNg
Composée d’une populationde vecteurs identiques: qui ont tous un gragment différent et aléatoire du génome. Ensemble forme le gènome complet. On a accès au promoteur!
Comment on fait pour spot un gène chez organisme si il se peut qu’il y ait eu une mutation silencieuse (mutation sur le 3e AA sur un codon)?
On va faire des sondes qui vont être + large => englobe les différentes possibilités du 3e AA sur un codon
Ex:
Cys-Met-Asp
TG(T ou C) - ATG - GA(T ou C)
Comment fonctionne les contacts cellule-cellule?
- C. va avoir une protéine des signalisations extracellulaires
- Cette prot est reconnue par un récepteur spécifique à la surface de la c. cible. (besoin d’être très proche)
- Quand prot signal est lié=> modification de la conformation interne du récepteur => modification de l’expression des gènes de réponse dans la cellule cible.
Origine des prot de signalisation cellulaire dans contact cellule-cellule
-déposées dans sa membrane plasmique,
ou
- sécrétées dans la matrice extracellulaire.
Les molécules de signal à la surface de cellule contrôle expression des gènes de quels cellules?
Seulement cellule physiquement en contact direct
Les 2 types de contacts cellule-cellule
Inhibition latérale: va changer l’expression génique des cellules en contact direct avec elle
Signalisation inductive: Va faire des changements géniques qui vont se passer de cellule en cellule
Exemple de contact cellule-cellule dans le développement neural
- Neuroblaste expriment DELTA (prot de signalisation) & C. épidermiques expreminent NOTCH
- Liaison de NOTCH à DELTA => clivage protéolytique de la portion intracellulaire de NOTCH
- Cette portion voyage jusqu’au noyau et inhibe les gènes qui font la différenciation en neurone => différenciation en c. de l’épiderme
Struture de notch
un récepteur hétérodimérique à un passage transmembranaire.
NOTCH et le gène
Sans Notch: l’activateur de la transcription Su(H) forme un complexe avec les protéines Hairless, Groucho et CtBP. => réprime transcription des gènes en aval, qui sont des répresseurs de la différenciation neuronale.
Avec NotchL: déloge les protéines liées à Su(H) et la transcription des gènes est activée.
Qu’est-ce qui peut dicter la différenciation?
Les gradients de morphogènes
Qu’est-ce qui forme le gradient de morphogènes
Établissement de l’info de position par des molécules signal sécrétées:
- Petit groupe de c. synthétisé et sécrète une mol signal qui forme le gradient extracellulaire
Comment le gradient de morphogénèse peut contrôlé la différenciation?
Va dépendre du nombre de récepteur activé sur les c. (conc. de la molécule
• Cellules proches de la source = fortes con. → se développent en un type cellulaire particulier.
• Celles qui sont plus éloignées = conc. ↓ graduellement → suivent différentes voies de développement selon le niveau de concentration de molécules signal. (de moins en moins de gène activé)
Exemple de Sonic hedgehog et le dev neuronal
- Les cellules ventrales du tube neural (floorplate) sécrètent une molécule appelée Sonic hedgehog (Shh) qui fonctionne comme un morphogène. => gradient du bas vers le haut
- position des cellules le long du gradient détermine la concentration de Shh à laquelle elles sont exposées.
- Conc. détermine combien de récepteurs activés sur les cellule.
- Récepteur de Shh conduit à la migration ds le noyau de la prot Gli => active ou inhibe gènes dépendamment de sa conc.
Exemple de division asymétriques dans la formation de stomate chez les plantes
- 1ère division asymétrique: produit une petite cellule précruseur stomatique; le méristemoïde
- Localisation asymétrique contact c-c => cellules autour vont formé des cellule épidermique autour du stomate
D’autres divisions asymétriques permettent ensuite d’augmenter le nombre de cellules de la feuille et d’assurer l’espace nécessaire entre les futurs stomates
Que font SPCH et MUTE ds formation stomate?
SPCH: promeut la division asymétrique
MUTE: promeut la différenciation => c. en stomate. C. qui n’ont pas MUTE deviennet des c. épidermiques
Comment les c. savent qu’il deviennet des c. épidermiques?
Absence de mute fait juste qu’elle ne deviennet pas stomate
Par un contact c.-c. de la c. méristémoïde qui sécrète 2 peptides (EPF1 et EPF2) capté par récepteur transmembranaire à la surface des c. de l’Épiderme
EPF1 va induire voie de singalisation MAPK qui réprime SPCH ds c. épidermique
Commutateur simple vs complexe
Simple: prot qui va activé ou inhibé gène
Complexe: Réseaux de gène qui s’active/s’inhibe l’une et l’autre pour voir si on active ou inhibe gène
Qu’est-ce qu’indique la blastoderme dans la différenciation?
Dépendament des positions (postérieur, antérieur) des cellules on peut déja prévoir si ça ve devenir une tête, thorax, etc..
Comment le gène Eve(even-skipped) est exprimé?
par 7 bandes de 4c. exprimé ensuite 4c. muette, ainsi de suite.
Sa région réulgatrice continet 5 enhancer responsable de l’expression ds les bandes spécfiques => ces amplificateurs (enhancer) répondent à la présence de combinaison d’activateurs et de répresseurs
Mécanisme de la bande 2 (enhancer de eve)
Est à 1kb du site de démaragge de transcription
A les sites de liaisons de Bicoid, Hunchback, Giant et Krupperl
Hunchback va être à grande conc. et les autres à basse conc.
Hunchback et bicoid sont les activateurs & Giant et Krupperl sont les inhibiteurs => plus d’activateur => activation du enhancher => expression du gène
Mécanisme des bandes 3 et 4 (enhancers de eve)
Hunchback et Knirps jouent le rôle de répresseur.
Le gradient de conc. de hunchback est plus concentré à gauche et moins à droite
Le gradient de conc. de Knirps est plus concentré à droite et moins à gauche.
Les gène eve va être activé dans 2 situations
- Conc. de Hunchback est juste pas assez pour réprésser et knirps est juste bas => bande 3 est activé
- Conc. de Knicks est juste pas assez pour réprésser et Hunchback est juste bas => bande 4 est activé => eve
Les 3 techniques pour comprendre les commutateurs génétiques complexes
In vitro
-co-immuno-précipitation
In vivo:
- Système double hybride
- Immunoprécipitation de la chromatine
Idée de base de la chromatographie sur colonne
Purifier la protéine
Comment fonctionne le chromatographie sur colonne?
- Un va utiliser une protéine de fusion, comme GST facilement purifiables, qui va se lier au gène d’intérêt.
- On insère un site thrombine entre gène d’intérêt et GST pour ensuite pouvoir enlever le tag GST par l’enzyme thrombine
- La portion GST va se lier au glutathion, donc les 2 moitiés de la prot de fusion vont être séparé
Comment fonctionne la co-immunoprécipitation
C’est in vitro
1. 1. On purifie d’abord la protéine connue avec des billes couplées à des anticorps (ou couplées à la glutathione).
2. On incube un extrait protéique avec ces billes. 3
. Après lavage, on dépose les billes sur gel. Seules les protéines du complexe seront isolées.
4. Analyses (par western blot)
Comment fonctionne le systéme du double hybride?
Repose sur l’organisation modulaire des facteurs de transcriptions
Prenons GAL4 comme exemple:
1. GAL4 possède domiane de liaison à l’ADN et domaine de liaisons des cofacteurs pour l’initation de la transcription
2. On fait un fusion entre prot connue (appât) et portion liant l’ADN du facteur de transcription GAL4
3. La prot inconnue va se lier à l’appât et aprés on voit si elle permet la transcription ou non.
C’est quoi l’organisation modulaire des facteurs de transcription
En gros, ils ont 2 domaines:
1 domaine qui se lie au gène
1 domaine qui fait l’activation
Quel technique permet de suivre les interactions entre prot et ADN?
Immunoprécipitaion de la chromatine ChIP
Étapes de l’immunoprécipitaion de la chromatine
- Formation liaison covalente entre prot de fixation et ADN associé
- Lyse des cellules et fragmentation
- Un AC spécifique se lie à la prot d’intérêt et isole fragments liées par immunoprécipation
- Traitement avec protéinase => dégrade liaison covalente et libère fragment d’ADN de la prot
- Isolation de l’ADN et amplification par PCR
Explique l’approche Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip (ChIP-chip)
- Amplification PCR des fragments récoltés.
- Marqués par fluorescence + hybridés sur une puce ADN du génome.
- Les sites de liaison des protéines à l’ADN sont identifiés selon l’intensité de la fluorescence.
- On peut ensuite situer les séquences identifiées sur une carte du génome.
Explique le séquencage de l’approche chromatin immunoprecipitation
Formation d’une banque de séquences qui est ensuite analysée par séquençage à haut débit. On mesure ensuite la fréquence de chaque séquence obtenue par rapport au génome connu.
Plus précis que l’approche ChIP-chip
Que font les gènes homéotiques?
Responsable de la diversification des différentes parties du coprs. (enweille va dans cette direction pour créer une patte)
Chez animaux, on trouve que les gènes distaux Hox(A,B, ouD) font le développement des membres est que c’est son expression qui dicte si on a 1 doigt ou 5 ou 8
Chez l’humain, expression anormale de HoxA et HoxD sont responsables de la polydactylie
Gènes homéotiques chez drosophiles
8 gènes homéotiqes contrôlent la segmentation du corps de la mouche
Antennapedia: 5 gènes
Bithorax: 3 gènes
Perturbation du gène Antp (antennapedia)
Perturbation de la régulation: Si ANTP est surexprimé au niveau de la tête, des pattes complètes se développeront à la place des antennes…
Perturbation de la séquence protéique: Si au contraire ANTP est sous-exprimé au niveau du mésothorax, des caractéristiques liées aux antennes se développent au niveau des pattes…
Perturbation du gène Ubx (ultrabithorax)
Perturbation du gène: on a une 2e paire d’ailes
Rôle du gène Ubx
Ubx contrôle le dev du troisième segment thoracique, le métathorax. Ubx réprime spécifiquement les gènes qui sont rquie pour le dev du 2e segment thoracique. (inhibe la 2e paire d’ailes)
Comment ça des insectes ont 2 paires d’ailes (3mécanisme)
une modification au niveau de la voie Ubx.
(plus simple vers plus complexe)
1. Changement du profil d’expression d’Ubx de telle sorte qu’il soit perdu dans les progéniteurs des ailes arrière chez les lépidoptères.
2. La protéine Ubx est fonctionnellement distincte entre les mouches et les papillons
3. Chacun des cinq à dix gènes cibles qui sont réprimés chez la drosophile a eu sa séquence régulatrice modifiée de telle sorte qu’elle ne réponde plus à Ubx chez les papillons (celle utilisé chez papillons)
Donc pourquoi on a 5 doigts chez l’humain?
pas l’homologie (présence de même gènes)
Pas les gènes homéotiques (gènes qui font une partie du corps
C’est pas la régulation de l’ensmble de gènes pour les exprimer dans un même endroit
