Pharmacologie régénérative des maladies respiratoires obstructives Flashcards
Définitions :
Régénération ?
Réparation ?
Régénération endogène ?
Régénération exogène ?
Cellules souches ?
Cellules progénitrices ?
- Régénération : restitution ad integrum d’un tissu lésé à partir du tissu restant via prolifération et différenciation de cellules souches.
- Réparation : processus de régénération partielle avec cicatrisation
- Régénération endogène : à partir de cellules souches endogènes
- Régénération exogène : à partir de cellules souches exogènes, greffe de cellules souches par exemple
- Cellules souches : cellules multipotentes capables de se différencier en une variété de types cellulaires
- Cellules progénitrices : cellules ayant la capacité de se différencier en un type de cellule spécialisé. Contrairement aux cellules souches, elles sont plus différenciées, étant stimulées pour se différencier en leurs “cellules cibles”.
Régénération pulmonaire :
2 modèles de souris : Jeûne et pneumonectomie ?
Expérience 1 : on fait jeûner des souris pendant deux semaines puis on leur autorise une alimentation à volonté. Lors de la période de jeûne les souris perdent des alvéoles, et lorsqu’elles sont renourries elles reforment des alvéoles, on note une majoration de la surface alvéolaire. La perte alvéolaire est donc réversible grâce à la régénération. A noter que chez les adolescent-e-s anorexiques, il existe également une perte alvéolaire sans qu’on ait montré de régénération possible.
Expérience 2 : En post pneumectomie gauche chez la souris on note un doublement du poids sec du poumon droit et une augmentation du volume avec doublement de la surface alvéolaire. Il existe donc une néoalvéolisation. Il semble que cela soit grâce à des facteurs mécaniques car si on met une prothèse à la place du poumon gauche on n’observe pas de néoalvéolisation. La limite du modèle est qu’il n’y a pas de régénération post lésion induite sur le poumon, on se contente d’enlever du poumon sain et c’est également du poumon sain qui régénère (et pas un poumon déjà emphysémateux par exemple).
Régénération pulmonaire chez l’humain : Post-résection pulmonaire ? (3 exemples)
Première étude : Pneumectomie chez 230 enfants entre un et cinq ans (tuberculose ou autre), le suivi à 30 ans montre une expansion du poumon restant. Mais c’est un phénomène observé chez un enfant, qui est donc en croissance.
2012 case report : Femme de 33 ans subissant une pneumectomie pour adénocarcinome, on a noté une expansion du poumon restant associée à une déviation médiastinale dans la cavité controlatérale au bout de 18 ans de suivi. Donc sur une longue période.
2017 Etude prospective : 25 patients adultes lobectomisés et 7 pneumectomisés ; on ne note au bout d’un an aucune expansion pulmonaire sur le scanner, la seule chose qui s’améliore est la DLCO au cours du suivi. Mais le suivi est court, un an seulement.
Régénération pulmonaire chez l’humain : En post SDRA ?
Première étude : 80 survivants de SDRA sont suivis sur 5 ans, la CV est à 85% de la théorique à distance du SDRA avec récupération complète au scanner. Mais on n’a pas la fonction respiratoire avant le SDRA donc difficile de conclure.
Etude de 2020 sur la régénération post SDRA Covid-19 (séries autopsiques) : description de cellules intermédiaires entre pneumocytes de type II et pneumocyte de type I qui expriment le KRT8 et la claudine 4, ces cellules ont été appelées les Epithelial Intermediate Cell. Elles ont été identifiées grâce à la technologie Single Cell. Ces cellules intermédiaires s’accumulent également en cas de processus fibrosant chez la souris (modèle bléomycine).
Etude autopsique de 2 patients décédés d’un SDRA Covid : HTII-280 (nouveau marqueur des pneumocytes de type II) et Claudine 4 (marqueur des cellules intermédiaires). Chez les donneurs (témoins sains) pas de colocalisation des deux marqueurs alors qu’on observe jusqu’à 20% de colocalisation chez le patient numéro 2). On note également chez les patients en SDRA un Ki67 (marqueur de mitose) très marqué dans les pneumocytes de type II. Donc on note un phénomène de prolifération des pneumocytes de type II et des pneumocytes de type II présentant un phénotype intermédiaire, possiblement vers une différenciation en pneumocyte I.
Etude autopsiques de patients SDRA Covid 2021 avec Single Cell technology vs sujets contrôles : Les cellules de sujet contrôles sont étiquetées en bleu alors que les cellules de sujet Covid sont étiquetées en rouge. On observe qu’il y a moins de pneumocytes de type II chez les patients Covid mais ils possèdent beaucoup plus de cellules intermédiaires. AT2 (vert foncé figure a) correspondent surtout à des points bleus sur la figure b tandis que les cellules intermédiaires (vert clair figure a) correspondent surtout à des cellules rouges sur la figure b.
Il semble donc que les cellules intermédiaires soient associées à un phénomène régénératif post SDRA, mais il existe un biais important puisque cela a été étudié chez des patients décédés…
Formation d’organoïde de PII, quel support est nécessiare à leur formation ?
Méthode pour isoler les PII ?
Organoïde alvéolaire avec pneumocytes II en culture 3D dans un matrigel : on observe la formation de sphères alvéolaires qui sont creuses à l’intérieur ; les cellules expriment le SPC (donc sont des pneumocytes de type II) et des marqueurs de pneumocytes de type I. Il y a donc une organisation spatiale globale et une différenciation en pneumocytes de type I de certains pneumocytes de type II. Initialement on rencontrait des difficultés à cultiver des pneumocytes II en organoïdes à partir de pneumocytes de type II seuls. Il a fallu ajouter des fibroblastes à la culture pour permettre la formation des organoïdes. Donc la cellule progénitrice (pneumocyte de type II) est sous la dépendance du micro environnement composé entre autres de fibroblastes. On parle de Mesenchymental Stem Cell Niche. Désormais on supplémente le milieu de culture (par FGF7 notamment) pour permettre la formation d’organoïdes sans ajout de fibroblastes.
Récemment découverte de l’anticorps HTII-280 qui est un marqueur des pneumocytes de type II au même titre que SPC. On effectue un tri des cellules épithéliales par méthode FACS ou colonne magnétique : Anticorps HTII-280 sur bille aimantée, incubation du prélèvement pulmonaire digéré avec ces complexes. Puis récupération des complexes billes + anticorps + pneumocytes de type II (HTII-280 positives) grâce à un champ magnétique. Ensuite les cellules seront utilisées pour la formation d’organoïdes. Chez l’humain il est difficile dans ces organoïdes d’obtenir des pneumocytes de type I à partir des pneumocytes de type II.
Modèle de SDRA sur souris et observation des PII :
Modèle de SDRA souris (pas organoïde cette fois)
Modèle SDRA Grippal sur souris (SDRA réversible si tant est que la souris survive). On fait coder la SPC fluorescente en rouge pour voir les pneumocytes de type II, on note que juste après l’infection il n’y a plus de marquage rouge puis il réapparait dès J7 et continue d’augmenter à J21. Ce sont bien les pneumocytes de type II qui régénèrent.
Quelle observation sur PII avec marqueur TM4SF1 présent vs absent ?
Poumon humain sains, on repère les pneumocytes de type II par le HTII-280. On s’aperçoit qu’il en existe deux types, des TM4SF1 positifs et des TM4SF1 négatifs. On trie les pneumocytes II selon la positivité du marqueur.
On combine avec culture de fibroblastes pour formation d’organoïdes :
- Pneumocytes II totaux et fibroblastes (témoin) : Formations d’organoïdes
- Pneumocytes II TM4SF1 positifs seulement + fibroblastes (appelés AEP) : organoïdes obtenus de plus grande taille
- Pneumocytes II TM4SF1 négatifs + fibroblastes : pas d’organoïde obtenu
C’est donc une sous population de Pneumocytes de type II qui permet la régénération.
Régénération pulmonaire et BPCO : Données introductives
- 5% des décès dans le monde
- 200 millions de malades dans le monde
- Absence de traitement pharmacologique ayant modifié la mortalité.
- Atteinte des petites voies aériennes avec destruction des petites voies aériennes et emphysème (destruction alvéolaire) sans traitement ciblant ce mécanisme physiopathologique spécifique
- Limite des traitements anti inflammatoires et bronchodilatateurs
- Limite des stratégies avec greffe de cellules stromales mésenchymateuses car défaut d’engraftment, les cellules ne restent pas sur le site voulu, elles ont seulement un effet anti-inflammatoire transitoire
- Patient BPCO + emphysème est en général plus grave et présente une progression de la maladie plus rapide qu’un patient BPCO non emphysémateux
- Bioengineering n’en est qu’au stade très expérimental
Quelle place pour rétinoïdes ?
Rétinoïdes = ATRA (vitamine A), dont les gènes sont activés en cours de grossesse et permettent la septation alvéolaire chez le foetus.
2002 Essai clinique randomisé double aveugle : 20 patients emphysémateux sévères traités par placebo ou rétinoïdes. On n’observe pas de différence significative sur le score de densité alvéolaire au scanner au bout de 6 mois.
2006 Autre essai avec trois types différents de rétinoïdes : Aucun ne permet d’améliorer de la fonction respiratoire, la seule différence est sur la DLCO à 6 mois avec le HD-ATRA (un des trois rétinoïdes), mais sans différence significative sur le scanner sur 18 mois de suivi.
End point emphysème est très rarement choisi car il implique de choisir un critère scannographique. Et on a vu que lorsque la régénération a lieu cela prend plusieurs années voire des dizaines d’années…
Quels sont les différents types de fibroblastes ?
- Fibroblastes progéniteurs qui peuvent se différencier
- Septal alveolar fibroblastes : assurent la production d’élastine
- Lipofibroblastes : ressemblent à des adipocytes avec plein de gouttelettes lipidiques à l’intérieur, ils fourniraient aux pneumocytes II des lipides pour leur membrane cellulaire et la production de surfactant
Les fibroblastes se rapporchent physiquement des PII. Lesquels se rapprochent le plus ?
Selon le type de fibroblaste les organoïdes sont-ils différents ?
Expérience 1 : 3 types de souris transgéniques exprimant soit Axin2, soit PDGFR-alpha, soit Wnt2. Chaque type est marqué d’un autofluorochrome spontané différent. On regarde chez ces souris la distance entre leurs fibroblastes et leurs pneumocytes de type II. Les cellules AXIN2 et PDGFR-alpha sont plus proches des pneumocytes de type II.
Expérience 2 : Organoïdes de pneumocytes de type II, si on modifie le micro-environnement en changeant le type de cellules mésenchymateuses associées on obtient des tailles d’organoïdes différentes. Donc certains sous types de cellules mésenchymateuses ont des propriétés de niche c’est-à-dire qu’elles accompagnent la croissance des pneumocytes de type II. Les sous types de cellules mésenchymateuses qui ont les plus grandes propriétés de support pour les pneumocytes de type II sont regroupés sous le nom de MANC.
Lipofibroblaste: quel marquage ? permettent-ils la formation d’organoïdes ?
Expérience 3 : Il a été démontré également le rôle des lipofibroblastes (gouttelettes lipidiques avec lipides neutres à l’intérieur). On utilise un marquage ADRP pour les visualiser. Comment démontrer leur effet bénéfique ? On effectue un tri des pneumocytes de type II, ils sont mis en coculture avec d’un côté des lipofibroblastes (Lipidtox positifs) et d’un autre coté des Lipidtox négatifs : ce dernier groupe ne permet pas d’obtenir des organoïdes de grande taille contrairement au groupe Lipidtox positif.
Les cellules endothéliales peuvent elles jouer un rôle dans la régénération ?
Modèle de souris avec emphysème induit par l’élastase chez qui on note une diminution du nombre de cellules endothéliales. On leur injecte par voie systémique des cellules adipeuses, des fibroblastes, des cellules endothéliales. On obtient une amélioration de l’élastance, de la capacité inspiratoire. On observe que les cellules endothéliales injectées (marquées au GFP) se retrouvent dans l’angle des alvéoles, là où sont habituellement les pneumocytes de type II. Si on « joue » sur les cellules endothéliales dans un modèle de pneumectomie on peut induire une meilleure néoalvéolisation.
3 modèles pré-cliniques d’étude ?
A. Modèles animaux murins
- Pneumectomie : néoalvéolisation
- Emphysème induit par élastase à J21 : irréversible
- Emphysème induit par la fumée de cigarette : 6 mois d’exposition nécessaire donc plutôt long mais a l’intérêt d’être physiologique
- Modèles d’hypoalvéolisation néo natale induite par l’hyperoxie (dysplasie broncho-pulmonaire) : déterminants très précoces de l’alvéolisation adulte notamment le tabagisme maternel pendant la grossesse. Ceci permet un parallèle avec certains patients qui développent des maladies respiratoires en partie parce qu’ils partent avec une fonction respiratoire de base plus basse que la moyenne
B. Modèles semi-physiologiques
Cultures 3D à partir de cellules murines ou humaines, notamment sous forme d’organoïdes. Compliqué, culture ne tient que 3 à 4 semaines, pas que banque possible (contrairement aux hépatocytes).
C. Lung cut slices
Coupe de poumon humain (post chirurgie) en une petite lame de 10 à 20 microns d’épaisseur qui mise dans un milieu de culture et peut être gardée 7 à 15 jours. Il est possible d’y voir une néo-septation alvéolaire après adjonction de certains médicaments (notamment Metformine). Le problème c’est qu’on ne peut pas les congeler ni les garder longtemps à l’état frais.
3 voies de signalisation qui pourraient être des cibles pour la régénération ?
- Voies du développement
- Voie de la lipogénèse
- Voie de la sénescence
