PCR II

Question 1

Componenten PCR

Answer 1

• template DNA
• Primers
• Taq polymerase
• magnesium chloride
• Deoxynucleotide triophosphates (nucleotides)
• Reactiebuffer

Question 2

template DNA

wordt ook wel traget DNA genoemd

Answer 2

Het stuk DNA dat geamplificeerd moet worden. De meest DNA kits werken optimaal bij 0,5 en 2,5 ng/ul. Te veel wordt profiel overbeladen, herhalingen op loci wordt lastig te zien. Bij te weinig krijg je een profiel met artefacten en moeilijker te interpreteren..

Question 3

Primers

Answer 3

Startpunten om DNA te vermeerderen. Primers zijn 18- 30 nucleotides lang. C/G en A/T moet gebalanceerd. Primers zijn specifiek voor een locus.

Question 4

Hoeveel primers bij een PCR

Answer 4

Voor een PCR gebruiken we 2 primers
forward primer (3’ –> 5’)
reverse primer (5’ –> 3’)
Beide primers binden aan de 3’ kant.

Question 5

Design van een primer

Answer 5

niet te kort - bind aan meerde plekken in DNA sequentie
of te lang - binding wordt minder efficient en laat makkelijker los.
niet complimentair aan zichzelf - loop of hairpin
niet complimentair andere primer (primer - dimer)
GC-gehalte ligt tussen 45 - 60%
melting temperatuur (TM) - van de twee primers mogen deze niet meer den 5 graden verschillen.

Question 6

TM en TA

formules

Answer 6

de temperatuur waar 50% van de primer gebonden is aan het DNA
Tm = 2(A + T) + 4(G+C) | Ta = Tm - 5graden = 100% binding
Boven de 65 graden ontstaat de kans op secundaire structuren. Primers binden slechter aan template

Question 7

Taq polymerase

Answer 7

bouwt nucleotide in. actief 10 min op 95 graden.

Question 8

MgCl2

Answer 8

stabiliseert de binding van primers aan template DNA en dat de Taq goed werkt

optimale pH DNA = 7.8 (TRIS) en zoutcondities stimuleert Taq

Question 9

Wat is E.Coli

Answer 9

Dit is een bacterie waar vroeger de taq polymerase uit werd gehaald. Iedere keer als de 94 graden werdt bereikt werd deze inactief.

Question 10

Thermus aquaticus

Answer 10

Deze bacterie werd na e. coli gebruikt om taq polymerase uit te halen. Deze bacterie is bestand tegen hoge temperaturen. Optimale temperatuur 72 - 80 graden. Alleen was de polymerase van deze bacterie ook actief op kamer temperatuur.

Question 11

Ampli Taq Gold

Answer 11

Oplossing met taq polymerase die pas na 10 minuten op 95 graden actief. Daarom is de incubatie stap minimaal 10 minuten. Zo worden er alleen PCR gerelateerde producten geproduceerd.