PCR Flashcards
¿para qué sirve la técnica de PCR?
amplificar rápidamente un segmento específico de ADN
¿qué son los cebadores?
(primers) definen la región específica del ADN que se amplificará
fragmentos cortos de ADN sintético que se usan para desarrollar un PCR
tipos de PCR
standard - genotyping
hot-start - genotyping
high fidelity - cloning
end point - tamaño
digital - método cuantitativo
¿qué pasa cuando se incorpora erróneamente un nucleótido?
no se forman los puentes de hidrógeno
se hace una especie de burbuja dentro de la hebra
cambio conformacional (tensión en la hélice)
activa su actividad exonucleasa (eliminación de nucleótidos de uno de los extremos)
proof-reading: la exonucelasa quita la mispaired base y se libera la tensión
hot start se refiere a
que tienes que calentar la enzima para que se libere y sea funcional
pasos amplificación reacción en cadena polimerasa (PCR)
- desnaturalización:
- se rompe en dos cadenas
- a 94°C
- los oligonucleotidos pueden hibridar - alineamiento/apareamiento:
- los primers se unen a las secuencias complementarias en el ADN
- forward and reverse
- 54°C - extensión:
- Taq polimerasa sintetiza nuevas hebras basándose en la hebra templado/molde (el templado nunca va a cambiar)
- 72°C
ingredientes para reacción PCR
agua - solvente
buffer - solución con sales para estabilizar interacciones entre enzima y DNA
dNTPs - the building blocks, los que se van a ir añadiendo
Taq polimerasa - enzima que copia el ADN
MgCl2 - cofactor que requiere la polimerasa para poder llevar a cabo su actividad
polimerasa - actividad 5´⟶ 3´, actividad exonucleasa 3´⟶ 5´
forward primer
reverse primer
¿qué es Tm?
temperatura media
la que vamos a utilizar para hacer el alineamiento
la determina la secuencia del oligo
¿qué es un amplicón?
producto amplificado de una región de ADN
fragmento de ADN que ha sido duplicado varias veces durante un proceso de amplificación
función de los primers (oligonucleótidos)
marcar el inicio y final de la región que se desea amplificar
oligo grande = ___ especificidad
mayor
para meter un oligo a un plásmido se le pone un ____
sitio de restricción (secuencia específica de nucleótidos, que es reconocida y cortada por una enzima de restricción), así se sabe a donde se va a meter el fragmento de DNA
¿qué mide la PCR en tiempo real?
mide en que momento despega la curva, cuando arranca
¿qué es el Ct value?
número de ciclos de amplificación requeridos para que la señal de fluorescencia generada durante la PCR alcance un umbral predefinido
¿qué indica un Ct value bajo?
que la cantidad de material genético objetivo era alta, ya que se alcanzó el umbral de detección en pocas rondas
menor Ct = mayor concentración inicial
