ADN recombinante Flashcards
ADN recombinante
inserción de un fragmento de ADN en una molécula de ADN portadora (plásmido, virus o cromosoma)
¿de dónde se obtienen las enzimas de restricción?
de microorganismos
(bacterias…)
son producidas por bacterias como parte de su sistema de defensa contra virus bacteriófagos
¿qué hacen las endonucleasas?
reconocen y cortan desde el centro las hebras
¿para que sirven las enzimas de restricción tipo II?
para cortar ADN en lugares específicos
características de las enzimas de restricción tipo II
reconocen secuencias palindrómicas (que se leen igual derecho y al revés):
- espejo: GTAATG
- inversas repetidas: GTATAC
son homodímeros:
- tienen dos subunidades (proteínas) iguales que reconocen y cortan la misma secuencia
usan Mg2+ como cofactor
no usan ATP
cortan adentro de la secuencia
¿a qué se refiere la actividad estrella?
cortes inespecíficos en el DNA
¿a qué se debe la actividad estrella?
concentraciones de glicerol mayores a 5%
altas concentraciones de enzima por concentración de DNA 100 U/ug
buffer no óptimo
sustitución de Mg2+ con otros cationes
función DNA ligasa
reconoce el extremo OH donde se va a hacer el ataque nucleofílico
genera el enlace fosfodiéster
función alcalina fosfatasa
quita grupos fosfato, transforma grupos fosfato a OH
(si la molécula de DNA ya no tiene grupos fosfato ya no se puede ligar, ya no se va a hacer el enlace fosfodiéster)
elementos que tienen los plásmidos
origen de replicación:
- permite que el plásmido se reproduzca independientemente del cromosoma principal
marcadores de selección:
- permiten identificar y seleccionar células que han tomado el plásmido:
- amp (ampicilina)
- tet (tetraxiclina)
sitio de clonación múltiple:
- zonas donde se puede insertar
- en los primeros nucleótidos
¿qué es un plásmido?
molécula de DNA circular
vector lanzadera
ejemplo de un plásmido
pBR322
primer plásmido sintético
4361 pb (muy grande)
¿qué es un vector lanzadera?
molécula de ADN que transporta genes o secuencias de un organismo a otro
pasos para hacer un ADN recombinante
- se extraen fragmentos de ADN de un organismo
- se corta en fragmentos pequeños usando enzimas de restricción
- se fosforila para que no se circule (alcalina fosfatasa)
- ligación: se une a una molécula portadora mediante ligasas
- transformación: se introduce a un organismo hospedador
¿qué es hibridación?
dos moléculas complementarias de una sola hebra de ADN se unen y forman una molécula de doble cadena
