Mycobactériologie clinique (Cours 6) Flashcards
Quels sont principales infections à mycobactéries?
Tuberculose (M. tuberculosis), Lèpre (M. leprae), Ulcère de buruli (M. ulcerans) et mycobactérioses (Mycobactéries non tuberculeuses)(opportuniste, augmentation d’incidence)
Caractéristiques morphologiques des mycobactéries?
- Bâtonnets droits ou légèrement courbés - Aérobes obligatoires - Ne produisent pas de spores - Non mobiles - Embranchements possibles
Quelles sont les différentes couches de la paroi cellulaire des mycobactéries?
Capsule, lipides extractibles, squelette pariétal (= acides mycoliques, arabinogalactane et peptidoglycane), membrane plasmique.
Quelles sont les caractéristiques de la paroi cellulaire des mycobactéries?
- Contenu élevé lipides (60%) de la paroi
- Hydrophobe
- Empêche pénétration par colorations GRAM
- (procédures spéciales) ne se décolore pas facilement, même avec acide-alcool:
- Bacille alcoolo-acido-résistant (BAAR), “acid-fast”
Quels sont les habitats des mycobactéries?
Eau et sol
Pathogénécité de M. tuberculosis et M. Leprae?
Incapables de se multiplier dans l’environnement. Survie intracellulaire, multiplication dans les phagocytes (macrophages)
Comment se transmet M. tuberculosis?
Transmission aérienne via particules générées par la toux des patients avec TB pulmonaire active
Mycobactéries non tuberculeuses (MNT)
Habituellement pas partie de la flore normale humaine, mais peuvent être isolées des
voies respiratoires, intestins, et échantillons génitaux chez personnes
asymptomatiques, pas synonyme d’infection.
Quelle est la taxonomie des mycobactéries?
Ordre : Actinomycetales
Sous-ordre : Corynebacterineae
Famille : Mycobacteriaceae (>200 espèces)
• Un genre: Mycobacterium
Qu’est-ce que les acides mycoliques?
Acides gras complexes avec un nombre élevé de carbone (70-90)
Vrai ou faux. Le contenu du matériel génétique des mycobactéries est élevé? Quel %?
Vrai. 61-71%
Quels autres organismes contiennent des acides mycoliques?
Actinomycètes aérobiques (Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium,
Gordonia, Tsukamurella, Seignilipurus)
Quelles espèces de mycobactéries sont les plus pathogènes?
Complexe M. tuberculosis (MADO) M. leprae (MADO) M. ulcerans Mycobactéries autres que MTBC • Mycobactéries atypiques • Mycobactéries autres que TB (MOTT) • Mycobactéries non-tuberculeuses (MNT) Le nbre des espèces des mycobacteries augmente continuellement)
Qu’est-ce que la classification de Runyon?
• Croissance lente
Croissance > 7 jours pour produire colonies sur milieu solide en sous-culture (et non à la croissance initiale)
• Croissance rapide
Croissance < 7 jours
• Pigmentation
Photochromogène: pigmenté à la lumière seulement
Scotochromogène: pigmenté à la lumière et à l’obscurité
Aucune
Runyon Groupe I, donner:
Exemples, croissance et pigment.
Exemples : M. kansasii, M. marinum
Croissance lente
Pigment : Photochromogène
Runyon Groupe II, donner:
Exemples, croissance et pigment.
Exemples : M. gordonae, M. scrofulaceum
Croissance lente
Pigment : Scotochromogène
Runyon Groupe III, donner:
Exemples, croissance et pigment.
Exemples : M. intracellulare, M. avium, M. haemophilum
Croissance lente
Pigment : Non-photochromogène
Runyon Groupe IV, donner:
Exemples, croissance et pigment.
Exemples : M. fortuitum, M. chelonae, M. abcessus
Croissance rapide
Pigment : Pigmentés ou non
Quels sont les caractéristiques du complexe M. avium (MAC)?
Peu pathogène en général, Ressemble TB chez fumeurs et lymphadénite chez enfants.
Maladie disséminée chez pts avec SIDA
Sous-espèce M. paratuberculosis (MAP)
Croissance fastidieuse (nécessite additif = Mycobactine J)
Maladie Johne’s: iléite chronique des ruminants
Possiblement impliqué dans pathogénèse maladie de Crohn
Dans quel groupe de Runyon est le complexe M. avium (MAC)?
Groupe III, MNT nonphotochromogène.
Environ combien de nouvelles espèces de MNT émerge à chaque année?
Autour de 200
Quels sont les trois espèces incluses dans le complexe M. abscessus?
abscessus, bolletii et massiliense
Quel est le premier MNT au Québec et quels sont les subsp?
Complexe M. avium (MAC).
avium, hominissuis, silvaticum, paratuberculosis
Quels sont les autres pathogènes MNT au Québec? Ou sont-ils présents? Qui infectent-ils?
M. kansasii, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. abscessus et M. chelonae
Présent dans l’environnemnt.
Causent infections atypiques
chez l’hôte (défenses locales ou systémiques déficients)
Agées fragiles, sujets immunodéprimés, enfants
Quels sont les nouvelles espèces MNT émergentes?
Croissance?
• M. icosiumassiliensis (2016) Lente • M. virginiense (2017) Lente • M. malmesburyense (2016) Rapide I COliss ca VIRe MAL
Quelles sont été les conséquences du changement de l’état de l’hôte et la pathogénécité des microbes?
Apparition des parasites des animaux, des saprophytes.
Émergence de complexe M. chelonae et du groupe M. fortuitum
Quels sont les caractéristiques principales de M. Leprae?
Touche 11 M personnes Maladie chronique granulomateuse Lésions cutanées, muqueuses, oculaires Neuropathies périphériques Non cultivé in vitro Infections chez tatous (armadillos)
Quels sont les caractéristiques principales de M. ulcerans?
Régions tropicales, subtropicales et tempérées : Afrique, Amérique du Sud et Pacifique occidental
• Préfère température 30oC
• S’attaque à la peau et les os, et peut entraîner des déformations permanentes et des handicaps à long terme
Compléter :
Souches de tuberculose au québec _____________ ><= 1.5 %.
multirésistantes <=
Comment se fait la transmission de M. tuberculosis?
Transmission voie aérienne
Dose infectieuse faible, Dose infectante estimée < 10 bacilles
Microgouttelettes « droplet nuclei » (1–5 microns)
peuvent être transportées sur longues distances
Qu’est-ce qui caractérise la maladie active de TB?
Maladie pulmonaire surtout Affecte tous les organes, tous les âges Patients VIH ++ risque Radiographie pulmonaire anormale TCT ou TLIG peuvent être positifs ou négatifs
Traitement efficace contre la TB?
Existe mais long (min 6 mois) : combinaison de médicaments anti-tuberculeux: isoniazide,
rifampicine, éthambutol, pyrazinamide (IrRÉParable)
Diagnostic de la TB?
Challenge d’identification et antibiogramme
Décrivez la pathogénécité de la TB?
Phagocytose de TB par les macrophages dans les alvéoles. Formation de granulome caséeux avec des cellules épithélioïdes et couronne lymphocytaire.
Quels sont les espèces comprises dans le complexe M. tuberculosis?
M. tuberculosis, M. bovis et M. africanum
Quels sont les caractéristiques de M. bovis?
Cause TB animale = Bovins, chats, chiens, oiseaux. Peut aussi infecter les primates et humains / lait non pasteurisé Résistance (R) inhérente à la pyrazinamide 0-3 cas au Québec
Qu’est-ce que le BCG?
Bacille Calmette-Guérin. Vaccin vivant atténué
M. bovis sous-cultivé durant 13 ans, 1921
Distribué dans plusieurs pays (# souches)
Efficacité varie de 0 à 80%
Prévient seulement des formes sévères chez nourrissons (Méningites)
Encore donné dans les pays à forte
incidence (et autochtones)
Traitement du cancer de la vessie
Quels sont les caractéristiques de M. africanum?
Cause de tuberculose
En Afrique de l’Est et de l’Ouest (50% cas)
Colonies similaires à M. tuberculosis
0 à 6 cas / an au Québec
Souches plus sensibles aux antituberculeux
Sur quoi est basé l’évaluation des risques lors de la classification des microorganismes selon LAPHT?
Pathogénicité, dose infectieuse, mode de transmission, mesures préventives et traitements.
Groupe de risque 1
Risque faible pour individu, agent biologique non susceptible de provoquer des maladies chez travailleurs ou animaux en bonne santé. Ex = E. coli, M. Bovis. Non réglementés et non pathogènes.
Groupe de risque 2
Risque modéré pour individu, limité pour la collectivité. Peut provoquer une maladie mais n’est pas un danger sérieux.
• L’exposition en laboratoire provoque rarement une
infection qui entraîne une maladie grave; traitements efficaces et des mesures
préventives qui limitent le risque de propagation
• Ex M avium; M. abscessus
Groupe de risque 3
Risque élevé pour l’individu, faible pour la collectivité
Provoque une maladie grave pour humains/animaux, répercussions économiques sérieuses mais pas de transmission personne à l’autre, ou pouvant être traitée avec des agents antimicrobiens
Ex : Mycobacterium tuberculosis; Virus du Nil Occidental;
Bacillus anthracis; SRAS-CoV-2
Groupe de risque 4
Risque élevé pour l’individu et pour la collectivité
Provoque une maladie très grave pour les humains ou les animaux, il n’existe souvent pas de traitement et qui se transmet facilement d’un individu à l’autre, d’un animal à un humain ou inversement, directement ou indirectement, ou par contact.
Ex = Ebola
Quelles sont le directives de sécurité des échantillons de M. tuberculosis? Les exceptions?
NC3 = Culture, culot, sous-culture, préparation d’ADN avant inactivation, spécimen primaire suspecté, ATB, tests in vitro.
Exceptions NC2+ = Cultures GR3 scellés (lames, ..), traitement, inoculation dans tubes scellés.
Quels sont les milieux de culture pour les mycobactéries?
Solides = à base d'oeuf (LJ), fait pousser les mycobactéries et Agar + un peu de vert de malachite. Liquides = Monitoring continu, détection fluoro, mano et colorimétrique
Comment est fait l’identification phénotypique des mycobactéries ?
- Microscopie
Ziehl-Neelsen + Chauffage
Kinyoun, pas de chauffage, +phénol.
1. Fuchsine (colorant), 2. Acide+alcohol (décolorant), 3. Bleu de méthylène (contre-colorant) - Vitesse de croissance, production de pigments et aspects des colonies (rugueuses =TB)
Quels sont les particularités des génomes des mycobactéries?
Gain et perte de gènes = délétion = spéciation.
Virulence, paroi épaisse, plasmides sont rares.
Qu’est-ce que les RD?
Régions de délétion génomique, aucun rôle fonctionnel, phénotypique. = marqueurs phylogénétiques. Analyse RD permet une identification précise.
Expliquer le principe de détection par PCR des RD.
RD9 présent = Identifie M. tub. Amorces 2 et 3
RD9 absent = Membre complexe TB autres que M. tub. Amorces 1 et 3
Absence de TB = pas d’amplification.
Quels sont les séquences cibles dans l’études des mycobactéries?
- ARNr 16S
- ITS 16-23S (espace intergénique)
- rpoB (ARN pol)
- cpn60 (chaperone)
- hsp65 (protéine choc thermique)
- gyrB (gyrase
MLSA = 16S, 16-23S, rpoB et hsp65
Combien de pb du gène rrs (16S) sont séquencés pour les mycobactéries lentes? Rapides?
Lentes = 500 Rapides = 1400 (gène entier)
Comment est fait le séquençage de 1ère génération?
- Mélange réactif (ATCG, ddNTP, matrice, ADN pol, amorce
- allongement de l’amorce
- Migration et séparation des brins d’ADN à l’aide de l’électrophorèse capillaire en gel
- Résultat et analyse des séquences.
Comment est fait l’identification des espèces de mycobactéries par séquençage?
BLAST.
• Banque publique de séquences (millions de séquences)
• Vérification de la qualité de la séquence test (séquence, prélèvement,
pureté de souche…)
• Recherche de l’ensemble des séquences similaires
• Séquences des banques de données contre la séquence analysée
• Qualité et contenu de la banque (accessibilité, qualité, durabilité,
échange…)
Quelles sont les 4 étapes de la technique BLAST?
- Alignement des séquences
- Calcul des distances
- Matrice de distances
- Construction de l’arbre
Vrai ou faux. Le modèle utiliser pour l’identification des mycobactéries est peu précis.
Faux. Détecte chaque polymorphisme. Certains espèces découvertes diffèrent d’un seul nucléotide dans les 1400 pb des 16S.
Quels sont les limites du séquençage des mycobactéries?
16S identiques, amorce ne fonctionne pas, certains même séquence mais phénotypiquement différent. Différence niveau morphologique.
Quel est le principe de l’identification par sonde commerciale Inno-LIPA?
Line Probe Assay. Région intergénique 16-23S ARNr
- Extraction ADN mycobacterium
- Amplification par PCR
- Hybridation à des sondes immobilisées spécifiques à l’espèce
- Coûteuse et pouvoir discriminant moyen
Quels espèces sont identifiés par Inno-LIPA?
Complexe Mycobacterium tuberculosis, le complexe M. avium (MAC)
Quelles sont les méthodes d’épreuve de sensibilité du complexe M. tb? Pour quels espèces sont elles utilisées?
Méthode des proportions
= Complexe Mycobacterium tuberculosis (MADO – MATO)
Méthode de microdilution
= Mycobacterium non-tuberculeux (MNT)
Quel est le principe de la méthode des proportions?
Déterminer si une souche est S ou R à une donnée d’un antituberculeux → concentration critique
• Si proportion des souches R est > 1 % dans la population mycobactérienne → proportion critique.
• CC: la plus petite concentration antibio qui inhibe 95% la souche sauvage non exposée auparavant à cet ATB mais qui n’inhibe pas l’isolat d’un patient en échec de traitement
• CC n’est pas une CMI
Quel est le principe de la détection par la fluorimétrique?
Tube avec 3 étapes = plus haut rien, ensuite milieu de culture très riche et dans le fond détecteur avec des FO2 et F (fluorescence).
Culture positive = O2 empêche la fluorescence, lorsque l’O2 est utilisé = augmente fluorescence. Négative = peu de fluorescence) car bcp O2
Quels sont les premières intentions d’antituberculeux?
Isoniazide 0.1 & 0.4 ug/ml
Rifampicine 1.0 ug/ml
Éthambutol 5.0 ug/ml
Pyrazinamide 100 ug/ml
Que faire s’il y a résistance des premières intentions d’antituberculeux?
Injectables ▪ Capréomycine ▪ Kanamycine ▪ Amikacine Fluoroquinolone ▪ Ofloxacine ▪ Moxifloxacine ou Lévofloxacine ▪ Rifabutine ▪ Éthionamide ▪ Streptomycine ▪ Linézolide
Quels sont les types de résistance aux antituberculeux ? Quels types causent une alerte générale?
- TB pansensible: 83% guérison
- TB multirésistante (TB-MR ≈ 50% guérison)
Résistance à au moins INH + RIF - Pré-ultrarésistante (Pré-TB-UR) TB-MR/TB-RR + au moins 1 fluoroquinolone
- TB ultrarésistante (TB-UR ≈ 30% guérison)
TB-MR + au moins 1 fluoroquinolone
& au moins 1 injectable
(Capréo, Kan, Amk)
MR, pré-UR et UR.
Quelle méthode d’étude des résistances aux ATB contre TB est utilisé par le LSPQ? Quel est ses particularités?
Microdilution en bouillon.
Non approuvées FDA, ATB rapportés selon l’espèce testée. Détermine la CMI et prédit sensibilité ou résistance.
Pour le complexe avium, donner:
personnes vulnérables et la 1ère et 2ème ligne d’ATB
Personnes vulnérables : VIH, cancer, traitement
corticostéroïde, greffe d’organe ou de moelle osseuse.
1ere ligne
Clarithromycine, Amikacine
2e ligne (demande Médecin)
Moxifloxacine, Linézolide
CALMOS
Pour M. kansasii, donner:
symptômes et la 1ère et 2ème ligne d’ATB
Affecte le poumon, la peau et les tissus
1ere ligne: Rifampicine et Clarithromycine
2e ligne: Amikacine, Doxycycline, Amikacine,
Ciprofloxacine, Rifabutine,
Trimethoprim/Sulfaméthoxazole, Moxifloxacine,
Linezolide, Minocycline
Aussi pour : M. xenopi, M. simiae, M. malmoense …
Rénald et CLAire Aime Danser au Kansas
Quel est le mode d’action/résistance à la Rifampicine?
Rifampicine se fixe à la polymérase bêta et inhibe la transcription de l’ARN.
Mutation dans rpoB = Rifampicine ne peux plus se fixer sur la pol = transcription normale de l’ARN
Vrai ou faux. 5 groupes de mutations du gène rpoB donnent de la résistance à la Rifampicine
Faux. Il y a 4 groupes.
Quel est le mode d’action/résistance à la Isoniazide?
La molécule d’iso est activé par la catalase/peroxidase et inhibe ensuite la protéine InhA qui fait la synthèse des acides mycoliques de la paroi cellulaire.
Mutation par délétion dans la catalase = ATB pas activé OU mutation dans le promoteur de la protéine InhA qui permet synthèse faible acides mycoliques
Quel est le mode d’action/résistance à la Pyrazinamide?
PZA actif contre les bacilles à pH acide (Population dormante
inflammation active, vésicules, phagolysosome)
PZA inactif à pH neutre (bacilles jeunes ou à croissance active)
Le PZA est transformé en POA (par la PZase) et empêche le transport membranaire, inhibe synthèse ARN, protéine et transport aa + perturbe le potentiel membranaire
Mutation dans pncA empêche le fonctionnement de la PZase
Quels sont les intérêts de la détection moléculaire de la résistance aux antituberculeux?
• Déterminer le profil des mutations associées à la
résistance
• Implanter des méthodes plus rapides
• Adapter le traitement antituberculeux
• Limiter la transmission de la résistance
• Améliorer les programmes de surveillance
Quels sont les méthodes discutées dans le cours de détection moléculaire de résistance au antiTB?
Détection résistance RIF par sonde.
GenoType® MTBDRplus
Détection par GeneXpert MTB Rif-TB (rapide, autoriser pas Santé can et OMS)
Comment est fait la détection de résistance moléculaire au LSPQ?
Chez les Mycobactéries, pas de R via plasmides ou autres éléments
transposables (pas de transfert horizontal) = mutations conférant R aux médicaments sont situées sur génome.
- Rifampicine = mutation rpoB (ARN polymérase)
- Isoniazide = mutation gène katG (catalase) OU inhA (biosynthèse des acides mycoliques de la paroi)
- Pyrazinamide = mutation pncA (pyrazinamidase)
- Éthambutol= mutation embB (biosynthèse du peptidoglycane)
Vrai ou faux. L’absence de mutation n’exclut pas la possibilité d’une résistance phénotypique.
Vrai.
Quelles sont les méthodes de séquençage des souches TB résistantes du
Québec?
Antibiogramme et séquencage des gènes par SANGER (amplification, purification et séquencage bi-directionnel sur gel d’agarose)
Quelles sont les mutations principales TB au Qc?
- katG - PRÉDOMINE
- katG (10 nouvelles mutations) en 10 ans
- Promoteur inhA
- rpoB - MUT PRINCIPALE
- embB (Mutation 306)
- pncA (Délétion et mutation)
La mutation la plus commune dans les ATB contre TB est ?
Dans le gène rpoB de la Rifampicine.
Algorithme du LSPQ pour les échantillons de TB
Cultures sont recues : MGIT (1-3sem) ET séquencage des gènes de résistance (2-5 jours).
Concordant = émet
Discordan = re-test MGIT
Vrai ou faux. Si on a absence de mutation par séquencage = pas de résistance
Faux. Méthode moléculaire doit être comparée avec la
méthode classique d’antibiogramme (référence)
Que permettent les méthodes moléculaires?
- Racourcir le temps de réponse
- Adapter rapidement le traitement
- Comprendre le mécanisme de résistance et de transmission
Qu’a permis le séquençage de 2ème génération?
à détecter des souches MTB-UR. WGS par ion torrent. 30x couverture moyenne.
Comment fait-on pour établir un lien épidémiologique entre des cas de TB?
Génotypage.
Que permet le génotypage?
- Déterminer des caractéristiques épidémiologiques des souches
- Identifier la transmission des souches (Infection nosocomiale)
- Déterminer la contamination inter-laboratoire
- Confirmer une réinfection exogène /réactivation endogène
Quels sont les 3 marqueurs épidémiologiques de la TB?
IS6110
DR
MIRU
Quelles sont les méthodes associées à chacun des marqueurs epi avec leurs avantages et désavantages?
IS6110 = RFLP.
Discriminant, grand quantité d’ADN, technique laborieuse, échange diff entre labo.
DR = Spoligotypage
Polymorphisme des séquences répétées
MIRU = Variation du nombre de séquences répétées en tandem d’éléments génétiques (PCR).
Faciles à comparer, fait sur tous les nouveaux cas, concluant sur les souches venant d’ailleurs. Puissant mais parfois insuffisant dans les souches clonales circulant dans une communauté.
Vrai ou faux. Dans le PCR-MIRU, + le chiffre assigné est élevé, plus la taille est
importante et le nombre de copies répétées est élevé.
Vrai.
Compléter. Chaque locus MIRU a un ___________ différent
• La technique ___________ est plus discriminante mais
pourra etre associée à _____________.
Pouvoir discriminant.
MIRU 24
RFLP ou spoligotypage.
Quelles sont les avantages de MIRU-VNTR?
-Méthode basée sur la PCR
-Automatisée et rapidité
-Bonne stabilité des marqueurs
-Haute résolution
-Concordance avec les profils RFLP et spoligotypage : étude phylogénétique
-Format de résultat simple utilisable à grande échelle entre différents
laboratoires/régions
-Utilisée en épidémiologie moléculaire plus qu’en phylogénie
-Pouvoir discriminant puissant mais parfois insuffisant sur souche
clonale (Nunavik)
