Module 4 Flashcards
Combien de résidus faut-il pour obtenir une structure tridimensionnelle stable ?
Minimum de 40 résidus
La vaste majorité des protéines contiennent entre 100 et 1000 résidus.
Qu’est-ce qu’une protéine monomérique ?
C’est une protéine qui contient une seule chaîne polypeptidique.
Qu’est-ce qu’une protéine oligomériques, un homomultimère et un hétéromultimère ?
- Plusieurs chaînes polypeptidiques associées les unes avec les autres; aussi appelées protéines multimériques
- Chaque chaîne d’une protéine multimérique est appelé sous-unité.
- Lors que la protéine est formée de la répétition d’une seule et même sous-unité, c’est un homomultimère.
- Lors qu’elle est formé d’au moins 2 sous-unités différentes, c’est un hétéromultimère.
Quelle est la différence entre composition et séquence d’une protéine ?
La composition réfère à la nature des acides aminés qui composent le peptide ou la protéine (exprimer en pourcentage pour chaque type d’acide aminé formant la cellule)
La séquence est l’ordre dans lequel les résidus sont attachés les uns aux autres en commençant par l’extrémité N-terminale.
Qu’est-ce que l’ADN peut nous révéler sur une protéine ?
- Puisque l’ADN contient toute l’information nécessaire à la synthèse des protéines, la séquence en résidus d’acides aminés d’une protéine peut être déduite à partir de la séquence d’ADN correspondante.
- Il est possible d’obtenir : la structure primaire, la masse moléculaire et le point isoélectrique d’une protéine.
- On ne peut pas savoir le nombre de sous-unités, les modifications post-traductionnelle (acides aminées modifiés ou pont disulfure)
Expliquez «salting in» et « salting out »
À faible concentration de sels : il y a « salting in ». Les ions des sels aident à solubiliser les acides aminés et les protéines.
Lorsque la concentration en sels devient plus forte, les ions des sels accaparent l’eau. Il y a donc moins de molécules d’eau disponibles pour solubiliser les acides aminés et les protéines. La diminution de solubilité est appelée « salting out ».
Comment peut-on faire précipiter des protéines ?
En modifiant le pH et la concentration en sels de la solution.
- Lors que ce sont les protéines indésirables qui forment le précipité, on récupère le surnageant contenant notre protéine d’intérêt.
- Lorsque c’est notre protéine cible qui forme le précipité, cette étape de purification sert également à la concentrer.
Expliquez les principes de base de la chromatographie.
- Une colonne de chromatographie contient une substance insoluble appelée matrice, résine ou phase stationnaire. C’est la nature de la phase stationnaire qui détermine la propriété physicochimique utilisée pour la purification. L’échantillon à purifier est appelée phase mobile.
- On ajoute ensuite continuellement du solvant ce qui entraîne les différents composés vers le bas de la colonne. On parle alors d’élution et le liquide sortant est appelé éluat.
- On récupère l’éluat sous forme de fraction de volume prédéfini. Les différentes fractions sont ensuite analysées par spectrophotométrie pour détecter celles contenant les protéines d’intérêt.
De quoi dépend la vitesse d’élution ?
Dépend des interactions entre ces composés et la phase stationnaire. Les différentes protéines du mélange seront entraînées à des vitesses variables. Plus la protéine interagira avec la phase stationnaire, plus elle prendra de temps avant d’être élulée.
Qu’est-ce que la chromatographie d’exclusion ?
- Séparation selon la taille
- Phase stationnaire = billes de gel contenant des pores de grosseur contrôlée et connue
- Les grosses molécules ne peuvent pas entrer dans les pores donc elles migrent rapidement dans la colonne.
- Les petites molécules sont retardées car elles peuvent entrer et sortir des billes.
- En plus de purifier la protéine cible, on peut estimer sa masse moléculaire. Pour ce faire, on ajoute des un échantillon coloré de protéines de masse moléculaire connue et on compare le temps d’élution.
Qu’est-ce que la chromatographie par échange d’ions ?
- Séparation selon la charge Phase stationnaire : - colonne d'échange cationique : résine chargée - lie les cations (charges +) - colonne d'échange anionique : résine chargée + lie les anions (charge -)
Qu’est-ce que la chromatographie d’affinité ?
- Séparation selon l’affinité pour une autre molécule (utilise la spécificité de la reconnaissance moléculaire)
Phase stationnaire :
Polymère li de façon covalente à un ligand liant spécifiquement la cible
Ligand : coenzyme, substrat, anticorps, etc.
- Lors qu’un mélange de protéines circule à travers la colonne, seule celle qui a une affinité importante pour le ligand est retenue.
Pour éluer la protéine cible : en changeant le pH du flux de solvant, ce qui brise les interactions faibles entre le ligand et la protéine ou en ajoutant une solution contenant une forte concentration de ligand. Lorsque la concentration du ligand libre est beaucoup plus élevée que celle du ligand fixé à la résine, les protéines ont plus de chances de reformer les liaisons avec les molécules de ligand libre ce qui les libère de la colonne.
Qu’est ce que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ?
- Petite colonne pressurisée
- flux de solvant contrôlé par ordinateur
- Peut servir à presque tous les types de chromatographie sur colonne, il suffit d’utiliser une colonne qui contient la résine appropriée.
Quels acides aminés absorbent les UV ?
Les acides aminés contenant un cycle aromatique.
La tyrosine et le tryptophane ont un maximum d’absorption de la lumière à une longueur d’onde d’environ 280nm, tandis que la phénylalanine a une absorption maximale à une longueur d’onde 260nm.
À quoi sert la spectophotométrie ?
- mesurer l’absorption par un soluté de la lumière à une longueur d’onde donnée (absorbance). L’absorbance d’une solution contenant un soluté X est directement proportionnelle à sa concentration.
Quelles sont les différences entre la spectrophotométrie UV et la spectrophotocolorimétrie ?
- Spectrophotométrie UV est utilisée pour identifier les fractions qui contiennent des protéines lors d’une chromatographie. Si la solution est pure et que le coefficient d’extinction molaire est connu, on peut déterminer la concentration avec la loi de Beer-Lambert.
- Si on a un mélange de protéines ou bien qu’on ne connait pas le coefficient d’extinction molaire de la protéine, on peut les traiter avec des réactifs et selon leur coloration, on peut déterminer la concentration avec une courbe standard.
Décrivez le principe d’une méthode d’électrophorèse.
- Séparation des composantes d’un mélange selon leur vitesse de migration dans un champ électrique.
- Les molécules migrent vers l’électrode de charge opposée.
- Dépend de la charge, de la forme et de la masse moléculaire.
- Les molécules doivent traverser le gel. Les petites molécules migrent rapidement et les grosses molécules migrent plus lentement (plus de résistance).
Nommez et décrivez les étapes pour déterminer la structure primaire d’une protéine.
- Bris des ponts disulfures
- Avec un agent réducteur comme B-mercaptoéthanol
- Et un agent d’alkylation comme l’iodoacétate qui empêche les ponts de se refaire - Bris des interactions non covalentes
- Détruit par la chaleur, l’ajout d’un détergent comme le SDS ou d’un agent chaotropique comme l’urée - Composition en acides aminés
- Hydrolyse acide des liens peptidiques (conditions extrêmes)
- Réactif d’Edman (PITC) qui se lie au groupement amine de chaque acide aminé. Ils portent un cycle aromatique donc ils sont détectable par spectrophotométrie UV (254nm)
- Sépare les PTC-acides aminés par HPLC
- -> impossible de distinguer aspartate d’une asparagine et un glutamate d’une glutamine - Caractérisation des extrémités N et C-terminales
- Réaction avec le PITC. En ajoutant de l’acide trifluoroacétique, ça libère le résidu N-terminale. la caboxypeptidase libère le C-terminale. - Fragmentation des chaines polypeptidiques
- Méthode enzymatique ou chimique (endopeptidase qui sont sensibles aux prolines.) - Séquençage des fragments
- Dégradation d’Edman (on doit séparer les fragment avant l’analyse) ou la spectrométrie de masse (ne nécessite pas de séparation préalable, la plus utilisée) - reconstruction de la séquence
- Localisation des ponts disulfures.
- changement de masse indique la présence de ponts disulfure
Qu’est-ce que l’empreinte de masse peptidique ?
- Comparaison avec des bases de données
Remplace la dégradation d’Edman comme méthode principale de détermination de la structure primaire des protéines.
