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Biologie Cellulaire > Méthodes > Flashcards

Méthodes Flashcards

1
Q

Qu’est-ce qu’un artéfact?

A

Structure artificielle apparaissant lors de la préparation de l’échantillon pour son observation

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Q

Donner un exemple de cause d’artéfacts

A

Fixateurs: Causent la précipitation ou la coagulation de substances normalement dépourvues de structure dans la cellule

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3
Q

Comment prouver qu’une structure n’est pas un artéfact?

A
  • Préparer les échantillons de différentes façons
  • Différents fixateurs ou sans fixateur (congélation rapide et cryodécapage
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4
Q

Qu’est-ce qu’un grossissement efficace?

A

Grossissement ayant plus d’info que celui précédent
inverse = Grossissement stérile

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5
Q

Qu’est-ce que la limite de résolution (d)?

A

Expression quantitative de la capacité de grossissement efficace d’un appareil optique
distance minimale de 2 points qui peuvent être distingués comme tels

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6
Q

Si la longueur d’onde diminue, la limite de résolution….

A

diminue, et donc est meilleure

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7
Q

Comment régler le problème du grossissement efficace en lumière visible?

A

Amélioration de la limite de résolution en éclairant la préparation avec de courtes longueurs d’ondes

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8
Q

Comment régler le problème du grossissement efficace en lumière ultraviolette?

A
  • À 200 nm on réussit à baisser de moitié la limite de résolution par rapport à la lumière visible
    Inconvénients:
  • Optique en quartz et non en verre qi est opaque aux U.V.
  • Miroir à première surface (couche métallique non recouverte de verre)
  • Invisible pour l’oeil humain
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9
Q

Quels sont les instruments utilisés pour observer?

A
  • Microscope photonique moderne
  • Microscope électronique à transmission (MET)
  • Microtome
  • Ultramicrotome
  • Cryodécapage
  • Microscope électronique à balayage (MEB)
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10
Q

Quels sont les avantages et les inconvénients d’un Microscope électronique à transmission (MET)

A

Avantages:
- Faisceau d’électrons comme source d’éclairage améliore la limite de résolution
- Longueur d’onde moyenne est de 0,004 nm et la limite de résolution de 0,00025 um (1000x fois mieux que photonique)

Désavantages:
- Faire le vide
- Préparation très minces échantillon coupé très mince pour laisser passer les électrons à travers le spécimen
- cellules mortes
- Coût élevé

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11
Q

Quel est le calcul de la longueur d’onde?

A

Longueur d’onde (en nm)=. h/mv= 1,23/v^1/2

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12
Q

Quel est le calcul de la résolution?

A

d= (0,61x (longueur d’onde))/ O.N. = 0,16x(longueur d’onde)/nsina

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13
Q

Quelles sont les étapes de préparation du matériel pour la coupe?

A
  • Fixation
  • Déshydratation (alcool)
  • Intermédiaire (Xylène ou toulène)
  • Inclusion (Parafine fondue)
  • Microtome (coupe en fine couche)
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14
Q

Qu’est-ce qu’un microtome?

A

Couteau fixe, spécimen mobile pour couper en mince feuillet

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15
Q

Quel artéfact est introduit pas la préparation du spécimen?

A

Artéfact causé par le rinçage du spécimen dans le toluène qui cause l’élimination de lipides (éléments hydrophobes)

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16
Q

Quelles sont les étapes de la coupe par ultramicrotome?

A
  • Tissus placés dans une solution de fixation (Glutaraldéhyde, Tétroxyde d’osmium)
  • Tissus est déshydrater dans des solutions de plus en plus concentré en alcool ou acétone
  • diluer dans une solution de médium de plastique “embedding” (oxyde de propylène)
  • Final: Résines de type epoxy (Epon, Durcupan) plus fort donc coupes plus minces
  • Polymériser dans un four
  • trimer pour pouvoir le sectionner
  • couper à l’aide de l’utramicrotome avec un couteau de verre ou de diamant
  • Section flotte dans l’eau puis sécher
  • Tâcher avec une solution de métaux lourds
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17
Q

Comment prépare-t-on le matériel pour le cryodécapage?

A
  • Congélation dans l’azote liquide
  • Fracture grâce à une microhache
  • Décapage: sublimation
  • Ombrage : Mélange de platine et de carbone
  • réplique
18
Q

Comment peut-on améliorer le contraste des préparation en photonique?

A

Colorants usuels
- Approche empirique: technique que l’on juge strictement d’après le résultat
- Histocytochimie: Technique où l’on se questionne sur les raisons de la coloration

Fluorochromes
- Fluorescence primaire: Substances qui fluorescent naturellement
- Fluorescence secondaire: substance qui doivent être colorées par les fluorochromes
- Immunofluorescence

Cytoenzymologie

19
Q

Qu’est-ce que la fluorescence?

A

Système additif des couleurs primaires

20
Q

Quelles sont les deux techniques de fluorescence?

A
  • En lumière bleue
  • En UV
21
Q

Quelles sont les étapes de l’immunofluorescence?

A
  • Isolation des microtubules d’un cerveau bovin
  • Injection de tubulines purifiées et rappel (lapin)
  • Prise de sang
  • Précipitation des anticorps ( (NH4)2SO4
    Purification des anticorps par affinité et ajout des fluorochromes
  • Traitement de la cellule avec les anticorps fluorescents et diffusion par les pores de la cellule
  • Anticorps s’attachent aux microtubules
22
Q

Quelles sont les étapes de cytoenzymologie?

A

Substrat + (enzyme)—- Produit 1 + produit 2 + colorant

Produit +colorant = complexe coloré

23
Q

Comment peut-on améliorer le contraste des préparations en MET?

A
  • Imprégnation métallique
  • Coloration négative
  • Ombrage (avec ou sans réplique)
  • Cytoenzymologie
  • Immunocytochimie
  • Immunocytoenzymologie
24
Q

Qu’est-ce que l’imprégnation métallique?

A

Dépôt de métaux lourds sur les membranes ce qui augmente les contraste en bloquant les électrons

25
Q

Qu’est-ce que la coloration négative?

A
  • Solution de phosphotungstat bloque les électrons partout sauf le spécimen
  • Besoin d’un relief (structure tridimensionnelle)
26
Q

Qu’est-ce que l’ombrage?

A
  • Structure tridimensionnelle
  • Cloche sous vide avec métaux évaporé
  • Crée une mince couche métallique sur l’objet = ombre de l’objet
  • inversion photographique
27
Q

Qu’est-ce que la cytoenzymologie en MET?

A

Réaction de Gomori
B-Glycérophosphate + Phosphatase acide—— Glycérol + phosphate inorganique + PbNO3—— Phosphate de plomb (précipité dense aux électrons)

28
Q

Qu’est-ce que l’immunocytochimie?

A

Anticorps couplée à la ferritine
- Protéine dense aux électrons
- Protéine de stockage du fer (Fe3+) dans le foie

29
Q

Qu’est-ce que l’immunocytoenzymologie?

A

Anticorps couplés à une enzyme
DABH2 + H2O2—– DAB+ OsO4—- Ppt opaque aux électrons

30
Q

Comment améliorer le contraste des préparation en photonique?

A
  • Méthodes basées sur l’éclairage : observation contrastée de cellules vivantes
  • Autoradiographie
31
Q

Comment se passe le champ sombre?

A
  • Rayons déviés dans l’objectif par la préparation
  • Rayons transmis autour de la préparation
  • Condenseur parabolique
  • Diaphragme annulaire
  • Lumière (étape à l’envers)
32
Q

Comment se passe le contraste de phase?

A

Rayons de la lumière retardés (déphasage)
proche de 1/2= teinte de gris/ bleu augment avec le contraste de l’image
Bloque la lumière au centre, lumière se rend à l’objectif quand même

33
Q

Quelles sont les étapes de l’autoradiographie?

A

Photonique et MET
- Incubation des cellules avec un isotrope radioactif
- Lavage
- Fixation
- Déshydratation, paraffine, microtome
- Immersion de la préparation dans une émulsion photographique liquide
- Développement en chambre noire
- Détection des grain d’argent

34
Q

Quelles sont les alternatives à l’autoradiographie?

A
  • Films à rayons X
  • Système d’imagerie des rayons beta
35
Q

Qu’est-ce que le microscope électronique à balayage (MEB)?

A

Canon à électron sur le spécimen recouvert d’une fine couche métallique
électron secondaire se détache et capter par le récepteur
- Détecte le relief, 3D

36
Q

Quelle sont les étapes de centrifugation différentielle en milieu homogène?

A
  • Broyeur de Potter
  • Homogénat
  • 1000x la gravité= cellule lysées, noyaux
  • Mitochondries, lysosomes, peroxysomes
  • Microsomes rugueux (réticulum endoplasmique+ ribosome)
  • Détergent (sodium deoxycholate)
  • Membrane du réticulum endoplasmique et ribosome
37
Q

Quel est l’autre appareil de centrifugation utilisé?

A

L’ultracentrifugeuse

38
Q

Quel est l’équation de Stokes?

A

s= (dx/dt)/ g (coefficient de sédimentation)

39
Q

Qu’est-ce que la centrifugation zonale?

A
  • Basée sur l’équation de Stokes
  • Homogénat déposé en surface d’un léger gradient de saccharose
  • Tous les constituants cellulaires peuvent atteindre le fond du tube si le temps le permet
40
Q

Quels sont les deux types de gradient de densité?

A
  • Discontinu
  • Continu
41
Q

Sur quoi est basé la centrifugation en gradient de densité?

A

Basé uniquement sur la densité

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