Méthodes Flashcards
Qu’est-ce qu’un artéfact?
Structure artificielle apparaissant lors de la préparation de l’échantillon pour son observation
Donner un exemple de cause d’artéfacts
Fixateurs: Causent la précipitation ou la coagulation de substances normalement dépourvues de structure dans la cellule
Comment prouver qu’une structure n’est pas un artéfact?
- Préparer les échantillons de différentes façons
- Différents fixateurs ou sans fixateur (congélation rapide et cryodécapage
Qu’est-ce qu’un grossissement efficace?
Grossissement ayant plus d’info que celui précédent
inverse = Grossissement stérile
Qu’est-ce que la limite de résolution (d)?
Expression quantitative de la capacité de grossissement efficace d’un appareil optique
distance minimale de 2 points qui peuvent être distingués comme tels
Si la longueur d’onde diminue, la limite de résolution….
diminue, et donc est meilleure
Comment régler le problème du grossissement efficace en lumière visible?
Amélioration de la limite de résolution en éclairant la préparation avec de courtes longueurs d’ondes
Comment régler le problème du grossissement efficace en lumière ultraviolette?
- À 200 nm on réussit à baisser de moitié la limite de résolution par rapport à la lumière visible
Inconvénients: - Optique en quartz et non en verre qi est opaque aux U.V.
- Miroir à première surface (couche métallique non recouverte de verre)
- Invisible pour l’oeil humain
Quels sont les instruments utilisés pour observer?
- Microscope photonique moderne
- Microscope électronique à transmission (MET)
- Microtome
- Ultramicrotome
- Cryodécapage
- Microscope électronique à balayage (MEB)
Quels sont les avantages et les inconvénients d’un Microscope électronique à transmission (MET)
Avantages:
- Faisceau d’électrons comme source d’éclairage améliore la limite de résolution
- Longueur d’onde moyenne est de 0,004 nm et la limite de résolution de 0,00025 um (1000x fois mieux que photonique)
Désavantages:
- Faire le vide
- Préparation très minces échantillon coupé très mince pour laisser passer les électrons à travers le spécimen
- cellules mortes
- Coût élevé
Quel est le calcul de la longueur d’onde?
Longueur d’onde (en nm)=. h/mv= 1,23/v^1/2
Quel est le calcul de la résolution?
d= (0,61x (longueur d’onde))/ O.N. = 0,16x(longueur d’onde)/nsina
Quelles sont les étapes de préparation du matériel pour la coupe?
- Fixation
- Déshydratation (alcool)
- Intermédiaire (Xylène ou toulène)
- Inclusion (Parafine fondue)
- Microtome (coupe en fine couche)
Qu’est-ce qu’un microtome?
Couteau fixe, spécimen mobile pour couper en mince feuillet
Quel artéfact est introduit pas la préparation du spécimen?
Artéfact causé par le rinçage du spécimen dans le toluène qui cause l’élimination de lipides (éléments hydrophobes)
Quelles sont les étapes de la coupe par ultramicrotome?
- Tissus placés dans une solution de fixation (Glutaraldéhyde, Tétroxyde d’osmium)
- Tissus est déshydrater dans des solutions de plus en plus concentré en alcool ou acétone
- diluer dans une solution de médium de plastique “embedding” (oxyde de propylène)
- Final: Résines de type epoxy (Epon, Durcupan) plus fort donc coupes plus minces
- Polymériser dans un four
- trimer pour pouvoir le sectionner
- couper à l’aide de l’utramicrotome avec un couteau de verre ou de diamant
- Section flotte dans l’eau puis sécher
- Tâcher avec une solution de métaux lourds
Comment prépare-t-on le matériel pour le cryodécapage?
- Congélation dans l’azote liquide
- Fracture grâce à une microhache
- Décapage: sublimation
- Ombrage : Mélange de platine et de carbone
- réplique
Comment peut-on améliorer le contraste des préparation en photonique?
Colorants usuels
- Approche empirique: technique que l’on juge strictement d’après le résultat
- Histocytochimie: Technique où l’on se questionne sur les raisons de la coloration
Fluorochromes
- Fluorescence primaire: Substances qui fluorescent naturellement
- Fluorescence secondaire: substance qui doivent être colorées par les fluorochromes
- Immunofluorescence
Cytoenzymologie
Qu’est-ce que la fluorescence?
Système additif des couleurs primaires
Quelles sont les deux techniques de fluorescence?
- En lumière bleue
- En UV
Quelles sont les étapes de l’immunofluorescence?
- Isolation des microtubules d’un cerveau bovin
- Injection de tubulines purifiées et rappel (lapin)
- Prise de sang
- Précipitation des anticorps ( (NH4)2SO4
Purification des anticorps par affinité et ajout des fluorochromes - Traitement de la cellule avec les anticorps fluorescents et diffusion par les pores de la cellule
- Anticorps s’attachent aux microtubules
Quelles sont les étapes de cytoenzymologie?
Substrat + (enzyme)—- Produit 1 + produit 2 + colorant
Produit +colorant = complexe coloré
Comment peut-on améliorer le contraste des préparations en MET?
- Imprégnation métallique
- Coloration négative
- Ombrage (avec ou sans réplique)
- Cytoenzymologie
- Immunocytochimie
- Immunocytoenzymologie
Qu’est-ce que l’imprégnation métallique?
Dépôt de métaux lourds sur les membranes ce qui augmente les contraste en bloquant les électrons
Qu’est-ce que la coloration négative?
- Solution de phosphotungstat bloque les électrons partout sauf le spécimen
- Besoin d’un relief (structure tridimensionnelle)
Qu’est-ce que l’ombrage?
- Structure tridimensionnelle
- Cloche sous vide avec métaux évaporé
- Crée une mince couche métallique sur l’objet = ombre de l’objet
- inversion photographique
Qu’est-ce que la cytoenzymologie en MET?
Réaction de Gomori
B-Glycérophosphate + Phosphatase acide—— Glycérol + phosphate inorganique + PbNO3—— Phosphate de plomb (précipité dense aux électrons)
Qu’est-ce que l’immunocytochimie?
Anticorps couplée à la ferritine
- Protéine dense aux électrons
- Protéine de stockage du fer (Fe3+) dans le foie
Qu’est-ce que l’immunocytoenzymologie?
Anticorps couplés à une enzyme
DABH2 + H2O2—– DAB+ OsO4—- Ppt opaque aux électrons
Comment améliorer le contraste des préparation en photonique?
- Méthodes basées sur l’éclairage : observation contrastée de cellules vivantes
- Autoradiographie
Comment se passe le champ sombre?
- Rayons déviés dans l’objectif par la préparation
- Rayons transmis autour de la préparation
- Condenseur parabolique
- Diaphragme annulaire
- Lumière (étape à l’envers)
Comment se passe le contraste de phase?
Rayons de la lumière retardés (déphasage)
proche de 1/2= teinte de gris/ bleu augment avec le contraste de l’image
Bloque la lumière au centre, lumière se rend à l’objectif quand même
Quelles sont les étapes de l’autoradiographie?
Photonique et MET
- Incubation des cellules avec un isotrope radioactif
- Lavage
- Fixation
- Déshydratation, paraffine, microtome
- Immersion de la préparation dans une émulsion photographique liquide
- Développement en chambre noire
- Détection des grain d’argent
Quelles sont les alternatives à l’autoradiographie?
- Films à rayons X
- Système d’imagerie des rayons beta
Qu’est-ce que le microscope électronique à balayage (MEB)?
Canon à électron sur le spécimen recouvert d’une fine couche métallique
électron secondaire se détache et capter par le récepteur
- Détecte le relief, 3D
Quelle sont les étapes de centrifugation différentielle en milieu homogène?
- Broyeur de Potter
- Homogénat
- 1000x la gravité= cellule lysées, noyaux
- Mitochondries, lysosomes, peroxysomes
- Microsomes rugueux (réticulum endoplasmique+ ribosome)
- Détergent (sodium deoxycholate)
- Membrane du réticulum endoplasmique et ribosome
Quel est l’autre appareil de centrifugation utilisé?
L’ultracentrifugeuse
Quel est l’équation de Stokes?
s= (dx/dt)/ g (coefficient de sédimentation)
Qu’est-ce que la centrifugation zonale?
- Basée sur l’équation de Stokes
- Homogénat déposé en surface d’un léger gradient de saccharose
- Tous les constituants cellulaires peuvent atteindre le fond du tube si le temps le permet
Quels sont les deux types de gradient de densité?
- Discontinu
- Continu
Sur quoi est basé la centrifugation en gradient de densité?
Basé uniquement sur la densité
