Lab 6 Flashcards
L’étiquette MAT contient quoi
Des histidines qui vont etre utilise pour purifié, va se lier a colonne IMAC
Emplacement de étiquette et pourquoi
N terminale, facile a etre reconnaitre, mieux qu’a l’intérieur d e la protéine
Comment IMAC fonctionne généralement
Nickel sont sur colonne et vont se lier a nickel
Qu’est ce qui maintient nickel au billes
Ni est attacher par de l’eau et IDA (2 groupements carboxyles et azote de l’IDA et 3 molécules d’eau
IDA s’attache a billes
Quel acide aminé a affinité pour Ni
pleins a.a surtout histidine
comment pratéine attacher a colonne
his de étiquette MAT (qui a 4 His par étiquette prend place de eau, donc BEAUCOUP d’affinité)
Comment élué les protéines voulue de la colonne
L’imidazole va competitionner avec l’histidine de MAT et prendre sa place.
- Petite concentration d’imidazole pour les protéine non mat attacher avec faible affinité
- Grande concentration pour enlevé MAT qui sera toute seul
Problème d’imidazole
Inhibe enzyme T7
Comment enlevé imidazole
Technique de dessalage par ultrafiltration (utilise un petit filtre)
Technique de dessalage
membrane poreuse filtré, laisse seulement passer plus petit que 50 kDa. TOute les contaminants passe
On veut remplacer quelles tampon
Tampon d’élution avec tampon de stockage (Tween 20 va faire en sorte que protéine garde sa forme)
SDS-Page( faite de quoi?)
faite de polyacrylmamide
La polymérisation nécessite
du persulfate d’allumium et un catalyseur TEMED
Gel % et pores
Un gel avec un plus grand % d’acrylamide a des pores plus petit
Comment sds-page gel de protéine focnctionnne
électrode - a anode +, migration proportionnelle a la taille, les protéine vont avoir une charge négatif. Petite protéine vont descendre plus rapidement
Pouruqoi les protéines sont négatif?
2 molécules du tampon de chargement donne protéines négatif:
- SDS: détergent, pertube intéractins polaires et hydrophobique de strture tertiaire. SDS est nég qui va rendre protéine NÉGATIVE! inépendante de la migration distance.
- B-mercaptoéthanol: Réduits les ponts disulfures dans la strucuture tertiaire de poréine, il dénature protéine
Comment visualiser protéines
Coloré gel soit le bleu Coomassie - il se lit au groupement amino et carboxyl des protéines fortement et faiblement au gel.
On fait décoloration du colorant lié au gel toute en gardant colorant au protéine
Nous on utilise au lieu le GelCode Blue: débrasse coloration du gel juste sur protéine
what does sds permit
trouver poids moléculaire de protéines
quel sorte de liens se font entre IDA et avec les billes
liens covalents
Quel types de liens se font entre les Mat-tag et les Nickel
Liens chélateur
loi de beer lambert
A=coefficient d’extinction b C
C est en molarité (mol/L)
demande pour concentration non dillué et comment faire conversion
x4 si concentration est une dillution x4
avec masse molaire
Abondance relative de tyr et trp sont de 2,3% et 1,3%
1 tyr contribue a 1480 extinction globale
1 trp contribue a 5540 extinction globale
c’est quoi extinction globale de 350 a.a
2,3% de 350 =a
1,3% de 350 = b
a(1380)+b(5540)
= réponse
