Lab 4 Flashcards
Controle de ligation avec pTAC digérer par HindIII et EcoRI: traitement de ligation
Pas d’amplicon donc teste si digestion c’est bien passer, si ferme sur lui meme un enzyme n’a pas fonctionner. Si cela c’est passer plus de colonies que I sa ne vaut pas la peine de continuer
Controle de ligation ptac digéré par HindIII uniquement
Pas d’amplicon, teste si ligase fonctionne bien, devrait y avoir beacuoup de colonies
Aucun ADN controle négatif - controle de transformation
DEvrait pas y avoir de colonies, contamination ADN ou bien ampicilline ne fonctionne pas
p-tac digéré par HindIII et EcoRI sans ligase - controle de la transformation
notrmale d’avoir quelque colonies, teste si vecteur n’a pas bien digéré
Controle de transformation ptag non digéré, vérifie compétenance, 10 a la 5 et a la 6
comment sa ce fait que colonies sont présente sans l’insert
Le vecteur ferme sur lui meme sans l’insert a cause d’une mal digestion
est ce qu’il peut y avoir plus qu’un plasmide par bacteries
oui
QU’est ce qui nous indique nombre de plasmide
Origine de réplication inidique combien de plasmide par bactéries
Minipréparation d’ADN plasmidique étapes
1) resuspension des bactéries
2) La lyse des cellules - NaOH et le SDS dénature lyse cellules et dénaturation de plasmid et chromosome bactérien
3) La neutralisation de la solution: Avec K+, ADN plasmidique capable d’etre recirculariser maispas chromosomique
4)La clarification dy lysat
5) La précipitaion de l’ADN: ADN plasmidique se retrouve dans le surnageant
Resuspension des bactéries
Cultures de bactéries vont etre centrifuger pour isoler bactéries. On resuspendue dans milieu isotonique (glucose et Tris-HCl permet se balance)
EDTA: Previent la dgradation de l’ADN
ARNase va digéré toute ARN surtout ARNr qui est très présente en nucléotides
Lyse des cellules
Mettre tampon lyse:
NaOH: alkalin, monte pH qui dénature ADN chromosomique et plasmétique
SDS: Déntaure protéine et englobe lipides. Boules autour de lipides pour s’en débarasser. ingrédient de shampoin
La neutralisation
Rammene le pH au bon pH, renaturation de ADN possible chez plasmide mais pas ADN chromosomique ne peut pas faire
clarification du lysat
Centrifugation - surnageant va etre notre plasmide, quelque autres déchets mais surtout plasmide
Précipitation de l’ADN
L’ADN est très soluble dans milieu aqueu, il est hautement soluble dans l’eau
IOn K+ et Na+ vont s’intercaller dans ADN phosphates, remplace eau par ions et on enlève eau avec éthanol. Permet plus forte liasion des ions au phosphate. Précipité va se former
Basse température aide aussi
Colonne a matrice liant ADN
Tampon NTI contient un sel chao/tropique - formation de chao. Solution d’ADN dans de l’eau et resuspendue. Il vont faire la meme chosse que Na+ font un pont salin entre sillice et ADN. Va s’attacher a la matrice faite de sillice. enlève impuretés
Pour éluer, on va ajoté beacuoup d’eau pour dilluer ions ponts salin
