Lab 2

Question 1

Ou provient le noms des endonucléases:

Answer 1

Des bactéries ou elles ont été isolé

Question 2

Comment endonucléase focntionne?

Answer 2

Méthyl transferase va mettre méthyle sur séquence d’enzyme de resrtiction, l’enzyme endocunléase ne peut alors pas couper dans ADN bactérien. Lorsque ADN inconnue entre il se fait couper a ces memes sites car ils n’on pas de méthyle

DONC endonucléase coupe ADN non méthyler

Question 3

Comment le clivage se fait-il?

Answer 3

Utilise molécule d’eau pour briser lien phosphodiester pour crée une extrémité 5’ phosphate et 3’ OH (a savoir!)

Question 4

Quels sont les trois types de bouts produits par les edonucléases de restriction:

Answer 4

• Bouts cohésifs a extrémité 5’ protibérant (les grands bouts a 5’ ont Phosphates)
  
  • Bouts cohésives 3’ protubérance (les grands bouts a 3’ on OH)
    Bouts francs: ON NE VEUT PAS CELA, difficile en ligation

Question 5

Que fait la ligase

Answer 5

Reforme lien phosphodiester entre extrémité compatible 5’phosphate et 3’ hydoxyle. Utilise de l’ATP!!!!

Question 6

Le ratio molaire d’insert a vecteur dépend de:

Answer 6

• Type de vecteur
• Taille des fragemnts d’ADN
• Nature des bouts d’ADN (cohésives ou franc)

Question 7

Calculs de ratio d’insert?

Answer 7

((Quantité d’insertlongueur de l’insert)/Longueur du vecteur)ratio molaire

Question 8

Controles de ligations

Answer 8

• Contrôle négatif: que le vecteur, on ne veut pas voire de plasmides circulaires, Digestion non optimale. Sa surveille qualité de digestion de plasmide. Si autant de plasmide circulaire dans celui-ci que notre expérience ne continue pas expérience
• Contrôle Positif: 100% de ADN dans positif devrait etre circulaire. S’assure que ligase ADN T4 est fonctionelle

Question 9

Sous-clonoage non directionnel:

Answer 9

Une seule enzyme utiliser, une chance sur deux que insert soit insérer dans la bonne orientation à l’intérieur du vecteur ou le vecteur va se fermer sur lui-même. Le bon c’est quoi le cadre de lecture du vecteur et l’insert on la meme direaction

Question 10

Déphosphorilation

Answer 10

• La phosphatase alcaline peut enlevé le Phosphate 5’ des vecteurs qui prébient autophosphorylation
  
  • Quand l’insert entre il y aura réparation
    On utilise pas déphosphorylation ce semestgre, mais sa aide a s’assurer au cas ou enzyme ne fonctionne pas mais on utilise directionelle so not rly a need its more like a precaution

Question 11

-ADN circulaire dans contrôle négatif dans contrôle négatif sa veut dire quoi

Answer 11

Un enzyme n’a pas bien fonctionner, on manque la matrice ADN donc sa veut dire que vecteur c’est fermer sur lui meme

Question 12

La ligase ne fonctionne pas si…

Answer 12

aucun des 2 brins ADN contient un groupement phosphate a 5’

Question 13

controle positif de ligation but?

Question 14

température de fusion des hybrides au premier et dergnier cycle de PCR

Answer 14

Premier cycle: regarde seulement a région d’amorce complémentaire avec ADN
Dergnier cycle: Regarde a amorce en entier

Question 15

Taux de recouvrement de la colonne du système nucleospine clean up

Answer 15

rendement = (quantité expérimentale/quantité expérimentale)*100

quantité exp = conc de ARN pol T7 purifié*volume d’ARN pol T7 purifié

quantité théorique = conc de partenaire 1x/98 microitre + con de partenaire 2x98

intensité = quantité

Question 16

déterminer la concentration et de vecteur purifier en utilisant la quantité d’ADN retrouvé sur le gel d’agrose. question 3 du devoir 2

Answer 16

quantité ADN*volume de tampon de chargement/volume de chargement *inconnue/volume de la solution purifié

Question 17

masse de l’insert/masse du vecteur=

Answer 17

longueur de l’insert/longueur du vecteur* ratio entre les 2 (par ex 3:1)