Klausur 25.03.2014

Question 1

Welche Antworten sind falsch? Plasmid Vektoren:

• • ln YAC-Vektoren befinden sich mindestens ein Ori und eine TEL-Region.
• • Die CEN-Region ist notwendig für die Amplifikation des Vektors in Prokaryonten.
• • Ori stellen die Replikation von Vektoren in Organismen sicher.
• • Die Klonierungskapazität von YACs hängt von der Größe der Phagenköpfe ab.

Answer 1

Falsch:

• • Die CEN-Region ist notwendig für die Amplifikation des Vektors in Prokaryonten.
• YACs werden in Bakterien vermehrt, nicht in Phagen -> unabhängig von Größe des Pagenkopfes

müsste das erste nicht auch falsch sein, weil man auf jeden Fall zwei TEL-Regionen benötigt? Für jedes Telomer-Ende eine.

Question 2

Sie führen ein Klonierungsexperiment durch. Ziel ist das Klonieren einer cDNA zum Zweck der Proteinexpression:

Welcher Vektor ist geeignet: …………………………….
Klonierungskapazität: ………….
Präparation der Ziei-DNA:………..
Wirtsorganismus: ……………………………………………
Einbringen in Wirt: …………………………………………………………

Answer 2

Welcher Vektor ist geeignet: Plasmid/Phage, Cosmid ; pTOPO oder pUC Vektor
Klonierungskapazität: Plasmid: 2-25kbp, Cosmid: 35-50kbp
Präparation der Ziel DNA: Herstellen von cDNA mit reverser Transkriptase, enzymatische Restriktion, Rekombination mit Vektor und Ligieren (T4 Ligase)
Wirtsorganismus: E. coli
Einbringen in Wirt: Transfektion mittels Phage

Question 3

Welche Proteine und DNA-Elemente werden benötigt für die Initiation der aktivierten Transkription? Gehen Sie dabei auf folgende Aspekte ein:Wie heißen die DNA-Elemente und wozu sind sie nötig? Welche Proteinfaktoren benötigen Sie neben der RNAP II noch?

Answer 3

Repressoren/Aktivatoren: binden an silencer und enhancer responsive elements
Sie enthalten reprimierende und aktivierende Domänen, diese gehen Proteininteraktionen ein und binden über co-Aktivatoren an Mediator bzw. DNA
Mediatorkomplex: Proteinomplex aus Head-, Middle- und Tail-Teil, interagiert mit TF und CDK8 Modul (Kinase) –> phosphoryliert RNAP 2 Schwanz
aktivator TAP rekrutiert z.B. RNAP2/Mediator

Oder: TFIID bindet DNA und beugt diese durch Interaktion mit dem core Promoter und den TAFs, damit RNA Pol II binden kann. Es folgt die Bindung von TFIIA, TFIIB und TFIIF, die durch das B-ribbon die RNA Pol fixieren, dadurch ist der fertige RIC gebildet und wird durch TFIIE und TFIIH kompletiert. Durch ATP kann er von der closed in die open Form übergehen.

Ist mit DNA-Elemten nicht sowas wie BRE, TATA, INR und DSE gemeint?

Question 4

Fragen zur RNAP II:

Was ist richtig zur RNAP II?

• • Die RNAP II assoziiert mit dem Mediator und Repressoren.
• • Im “poised”-Zustand produziert die RNAP II wenige,lange Transkripte.
• • Im “paused”-Zustand produziert die RNAP II kurze Transkripte.
• • Die RNAP II kann für erneute Initiation recycelt werden.

Answer 4

Richtig:
– Die RNAP II kann für erneute Initiation recycelt werden

– Im “poised”-Zustand produziert die RNAP II wenige,lange Transkripte. (wenige???)

– Im “paused”-Zustand produziert die RNAP II kurze Transkripte. (RNAP II produziert nach Phosphorylierung von Ser 5 ein kurzes Transkript mit Cap-Struktur, ist dann aber durch NELF & DSIF noch im paused-Zustand)

Assoziiert sie mit Repressoren???

Question 5

Was ist richtig zum CTD?

• • CTD steht für “( C-terminal decamer of RNAP II”).
• • Jedes CTD der RNAP II enthält 3 Serin-Reste.
• • Bei Aktivierung der RNAP II werden Serin-Reste in der Reihenfolge Ser5 -> Ser2 phosphoryliert.
• • Dabei werden beide ,Ser2 und Ser5, von P-TEFb phosphoryliert.

Answer 5

Richtig:
– Jedes CTD der RNAP II enthält 3 Serin-Reste. (Es können Ser 2,5,7 phopho. werden, es gibt aber doch bestimmt mehr oder??? )

– Bei Aktivierung der RNAP II werden Serin-Reste in der Reihenfolge Ser5 -> Ser2 phosphoryliert.

Falsch:

• C-Terminal Domain
• Ser 2 wird von pTEFb, Ser 5 von CDK7 phosphoryliert

Question 6

Erklären Sie, wie der Nukleäre Rezeptor ER (Östrogen-Rezeptor) Transkription an- oder abschalten kann.

Answer 6

Der ER bindet mit einem Zinkfingermotiv an ein bifunktionelles DNA Element (ERE) und wirkt dort reprimierend, da er CoR rekrutiert, welche mit dem LxxI/H IxxxI/L Motiv in die H3-H12 Furche binden können.
Der ER bindet Östrogen und durchgeht dann eine Konformationsänderung. Die AF-2 klappt hoch und verkleinert die Furche, nun kann nur noch das CoA Motiv LxxLL binden. Die Transkription wird so aktiviert.

Question 7

Was ist richtig zu Co-Aktivatoren (CoA)?

• • CoA sind meist Multi-Proteinkomplexe.
• • CoA phosphorylieren das CTD der RNAP II.
• • Weitere Enzymaktivitäten von CoA sind Acetylierung und Ubiquitinierung.
• • Transrepression erklärt man mit Squelshing von CoA.

Answer 7

Richtig:
–CoA sind meist Multi-Proteinkomplexe.
–Weitere Enzymaktivitäten von CoA sind Acetylierung und Ubiquitinierung.
–Transrepression erklärt man mit Squelshing von CoA
Falsch
– CoA phosphorylieren das CTD der RNAP II.

Question 8

Was ist richtig zu Co-Repressoren (CoR)?

• • Ein Transkriptionsfaktor kann mit verschiedenen CoR interagieren.
• • CoR können “ATP-abhängiges remodelling” von Chromatin bewirken.
• • Reprimierende DANN-Regelelementewerden von CoR methyliert.
• • Der Integratorkomplex verschaltet (integriert) Signale verschiedener basaler und reguIierender Transkriptionsfaktoren.

Answer 8

??
Richtig:
– Ein Transkriptionsfaktor kann mit verschiedenen CoR interagieren.
– CoR können “ATP-abhängiges remodelling” von Chromatin bewirken.
– Der Integratorkomplex verschaltet (integriert) Signale verschiedener basaler und reguIierender Transkriptionsfaktoren.

Question 9

Was ist richtig zu Riboswitches?

– Positive und negative Feedback-Regulation erfolgt auf Transkriptions- und auf
Translations-Ebene.
– Riboswitches finden sich meist in 3’ untranslatierten Bereichen (3’UTRs) von mRNAs von bakteriellen Stoffwechselwegen.
– Mögliche Stukturelemente sind three-stem-junction und four-stem-junction.
– Augrund der strukturellen Komplexität bestehen Riboswitches aus mehreren Kilobasen langen RNA-Segmenten.
– Der Ligand bindet an die Aptamer-Domäne.
– Ligand-freie und -gebundene Konformation sind sich ausschließende Strukturen.

Answer 9

Richtig:
– Positive und negative Feedback-Regulation erfolgt auf Transkriptions- und auf
Translations-Ebene.
– Mögliche Stukturelemente sind three-stem-junction und four-stem-junction.
– Der Ligand bindet an die Aptamer-Domäne.
– Ligand-freie und -gebundene Konformation sind sich ausschließende Strukturen.

Question 10

Das Aufschmelzen welcher regulatorischen RNA-Element ist hier gezeigt?
Bzw. Um es hier bessre zu beantworten: Beschreibe den Ablauf eines RNA heat-shock Thermometers

Answer 10

Höhere Temperatur sorgt für Aufschmelzen der Non-Watson-Crick BP in den ROSE Elementen bzw. dem Sensorhairpin.
(5´ Hairpin sichert Stabilität von 3´ Sensorhairpin bis zum Heatshock) Wenn Hairpin aufgeschmolzen ist Zugang zum RBS frei und die Translation kann ablaufen.

Question 11

Erklären Sie in Stichworten den Mechanismus der regulatorischen RNA des RNA Thermometers.

Answer 11

-RBS/AUG bei normaler Temperatur durch Paarung mit 5´UTR zu einer Sensorhaarnadel maskiert.
-Stabilität von Sensorhairpin durch stabile
5´Hairpins in ROSE Elementen gesichert.
-Entscheidend beim Aufschmelzen sind die nicht-Watson-Crick Basenpaarungen
–> Wenn Hairpin aufeschlmolzen ist RBS/AUG erreichbar und Translation/Transkription kann ablaufen

Question 12

Fragen beantworten zu den Regulatorischen RNAs: trans-kodierte,small RNAs
und cis-kodierte,antisense RNAs

ln welchen Genomen?
An welchem Ort im Genom lokalisiert (Bezogen auf das Gen der Ziel-mRNA)?
Grad der Basen- Komplementarität zwischen RNA und Ziel-mRNA?
Wie viele Ziel-mRNAs werden reguliert?

Answer 12

Für trans-kodierte small RNAs:

ln welchen Genomen: Bakteriengenom (nur da??)
An welchem Ort im Genom lokalisiert:
Auf anderem Gen kodiert als Ziel mRNA
Grad der Basen- Komplementarität zwischen RNA und Ziel-mRNA: partiell komplementär
Wie viele Ziel-mRNAs werden reguliert?:
es können verschiedene Ziel-mRNA targetiert werden

Für cis-kodierte, asRNAs:

ln welchen Genomen: Bakteriengenom, mobile Elemente wie Plasmide
In mobilen DNA-Elementen (Phagen, Plasmide) und bakterielle Genome
An welchem Ort im Genom lokalisiert (Bezogen auf das Gen der Ziel-mRNA)?:
Auf dem selben Gen lokalisiert wie Ziel-RNA
Grad der Basen- Komplementarität zwischen RNA und Ziel-mRNA?: vollständig komplementär
Wie viele Ziel-mRNAs werden reguliert?: Es wird nur eine Ziel-mRNA reguliert

Question 13

Was ist richtig zum CRISPR/cas-System?

– Durch CRISPR/cas besitzen Prokaryonten ein effizientes Abwehrsystem gegen
Eindringen von Fremd-DNA.
– CRISPR/cas kommt nur in Archaeen vor.
– Spacer sind in zufälliger Reihenfolge angeordnet.
– Je resistenter ein Bakterium gegen Infektionen verschiedener Bakteriophagen ist, desto mehr Spacer findet man in deren Genom.
– Spacer sind 26-72 bp lange,identische Sequenzen.
– Während der Interferenz-Phase wird die Fremd-DNA erkannt und durch CRISPR-cas­ Komplex abgebaut.

Answer 13

Richtig:
–Durch CRISPR/cas besitzen Prokaryonten ein effizientes Abwehrsystem gegen
Eindringen von Fremd-DNA.
– Je resistenter ein Bakterium gegen Infektionen verschiedener Bakteriophagen ist, desto mehr Spacer findet man in deren Genom.
– Während der Interferenz-Phase wird die Fremd-DNA erkannt und durch CRISPR-cas­ Komplex abgebaut.
(Abbau ja, aber durch Cas-protein/crDNA Komplex, ist das damit gemeint?? Denke ja…)

Question 14

Nenne zwei Humanimpfstoffe gegen Viren, dessen Antigene in Hefe produziert wurden.

Answer 14

Humanes Papillomvirus (HPV) (Gardasil, Cerverix) -> L1-Genprodukt=Kapsidprotein

Hepatitis B Virus (HBV) -> HBS Surface Partikel (Subunit Vaccine)

Question 15

Was ist beim Gendefekt X-SCID für ein Krankheitsbild zu beobachten?

Answer 15

Schwere Immundefizienz -> Bubble Boy disease
Defekte gamma-Kette im Interleukin-2-Rezeptor
-> Fast keine reifen T-Zellen da IL-Bindung und somit T-Zell-Differenzierung ausbleibt

Question 16

Was war der unerwartete Effekt bei der Gentherapie von X-SCID?

Answer 16

Es kam zu Leukämiefällen
-> wenn der Vektor mit dem Gen für die gamma-Kette sich upstream vom LMO-2 Gen integriert hatte
=Dieser ist TF und möglicherweise Protoonkogen
=Insertionsmutagenese

Question 17

Bei C. elegans wurden verschiedene Gene identifiziert, die homolog zum humanen IFG 1 /Insulintransduktionsweg sind. 
Ordne die Gene den Funktionen zu!
daf-2
age-1
daf-16

Kinase
Rezeptor
Transkriptionsfaktor

Answer 17

daf-2 = Rezeptortyrosinkinase -> Rezeptor + Kinase
age-1 = Kinase
daf-16 = FOXO Transkriptionsfaktor

Question 18

Verschiedene mutagene Substanzen haben verschiedene Effekte auf die Basen der DNA. Zuordnen!

Desaminierung
Alkylierung
Hydrolyse der glykosidischen Bindung

Abasische Stelle
Crosslinks zwischen Basen
Basen-Transition

Answer 18

Desaminierung = Basen-Transition
Alkylierung = Basen-Transition
Hydrolyse der glykosidischen Bindung = Abasische Stelle

Question 19

Was ist richtig: Glykosylasen findet man:

• BER short patch
• BER long patch
• NER
• Rekombinationsreparatur
• Nicht-homolge-Endverbindung (NHEJ)

Answer 19

Ritchtig:

• BER short patch
• BER long patch

Question 20

Was ist richtig zu Telomeren?

• • Telomersequenzen finden sich am Centromer.
• • Telomersequenzen werden durchgehend repliziert.
• • Telomersequenzen verlängern sich bei jeder Zellteilung.
• • Telomersequenzen können durch Telomerase verlängert werden.
• • Telomersequenzen bestehen aus DNA-Sequenz-Wiederholungen.
• • Telomersequenzen haben bei allen Organismen die gleiche Basenfolge.

Answer 20

Richtig:

• • Telomersequenzen können durch Telomerase verlängert werden.
• • Telomersequenzen bestehen aus DNA-Sequenz-Wiederholungen.

Question 21

Zellen besitzen ein System, um Superoxid-Anionen, eine ROS (reactive oxygen species), abzubauen.

a) Wie heißt das Enzym,das die Reaktion katalysiert?

b) Vervollständigen Sie den gezeigten Reaktionsmechanismus!
2 °O2- (Superoxidanion) + 2H+ —->

Answer 21

a) Superoxid-Dismutase

b) 2 °O2- (Superoxidanion) + 2H+
- —> H2O2 + O2

Question 22

Untenstehende Abbildung zeigt die Lichtreaktionen bei der Photosynthese.Beschriften Sie die leeren Kästen sowie die drei mit Pfeilen markierten Komplexe!
(Rohwedels Stanni Abbildung, füge ich ein sobald ich weiß wie es geht ;) Oder ihr wisst eh was gemeint ist )

Answer 22

PS II : H2O --> 1/2 O2 + 2H+
2H+ --> PQ --> PQH2
Cytb6f : --> 2H+
PS I
Am Ende: nH+

Question 23

In der Zellwand von Pflanzen haben verschiedene Polymere verschieden Funktionen. Zuordnen!

Glucoronoarabinoxylane
Xyloglycane
Rhamnogalacturonan
Zellulose

Glykane, die zellulose quervernetzen
Pektine
Zellulosegrundgerüst

Answer 23

Glucoronoarabinoxylane: Glykane
Xyloglycane: Glykane
Rhamnogalacturonan: Pektine
Zellulose: Grundgerüst

Question 24

Oxygene Photosynthese benötigt Chlorophylle, was ist richtig?

• Chlorophyll ist ein Protein, das Licht absorbiert
• Chlorophyll absorbiert ausschließlich Licht der Wellenlänge 600-700nm
• Durch Lichtenergie angeregte Chlorophyllmoleküle können Elektronen abgeben
• Chlorophyllmoleküle kommen auch in den Photosystemen vor

Answer 24

Richtig:

• Durch Lichtenergie angeregte Chlorophyllmoleküle können Elektronen abgeben
• Chlorophyllmoleküle kommen auch in den Photosystemen vor

Question 25

Was ist richtig zum Ti-Plasmid von Agrobakterium?

• Das komplette Ti-Plasmid wird bei Infektion in die Pflanzenzelle transferiert
• Ein Teil des Ti-Plasmids wird bei Infektion in die Pflanzenzelle transferiert
• Die vir-Gene kodieren für Proteine, die beim Transport eine Rolle spielen
• Die vir-Gene werden bei Infektion in die Pflanzenzelle transferiert
• Opin-Katabolismus-Gene werden bei Infektion in die Pflanzenzelle transferiert
• Tumor-induzierende Gene werden bei Infektion in die Pflanzenzelle transferiert

Answer 25

Richtig:

• Ein Teil des Ti-Plasmids wird bei Infektion in die Pflanzenzelle transferiert
• Die vir-Gene kodieren für Proteine, die beim Transport eine Rolle spielen
• Tumor-induzierende Gene werden bei Infektion in die Pflanzenzelle transferiert

Question 26

Bei der 3’Endprozessierung der Prothrombin-mRNA liegt ein Defekt vor, so dass die
Proteinexpression erhöht ist, was zu Thrombophilie führt. Welche Aussagen sind richtig?

– Eine DSE-Mutation (hier: zusätzliche U-Reste) erhöhen die 3’Endprozessierung,was den mRNA-Export verstärkt, wodurch wiederum die Prothrombin- Proteinexpression erhöht ist.
– Das Poly-Adenylierungssignal (AAUAAA) ist defekt, so dass die 3’Endprozessierung
verringert ist. Dies wird allerdings von einer weiteren DSE-Mutation aufgehoben,so dass die Proteinexpression letztendlich erhöht ist.
– Eine Mutation von CG zu CA in der 3’Schnittstelle ermöglicht eine bessere
3’Endprozessierung, was einen effizienteren Export aus dem Nucleus zur Folge hat.

Answer 26

Richtig:
- Eine Mutation von CG zu CA in der 3’Schnittstelle ermöglicht eine bessere
3’Endprozessierung, was einen effizienteren Export aus dem Nucleus zur Folge hat.

• Eine DSE-Mutation (hier: zusätzliche U-Reste) erhöhen die 3’Endprozessierung,was den mRNA-Export verstärkt, wodurch wiederum die Prothrombin- Proteinexpression erhöht ist.

Question 27

Welche Aussagen sind korrekt?

– NMD ist ein Qualitätskontrollmechanismus, der “Missense”-Mutationen in mRNAs erkennt, die 50-55 nt “upstream” von einer Exon-Exon-Verbindungsstelle liegen.
– NMD ist ein Qualitätskontrollmechanismus der Zelle, welcher im Zytoplasma der Zelle stattfindet und abhängig von mRNA-Translation ist.
– Nonsense-Mutationen, die 5’ von der NMD-Grenze liegen, aktivieren NMD in der Regel
schlechter als Nonsense-Mutationen,die 3’ von der Grenze liegen.
– NMD wird aktiviert, wenn ein translatierendes Ribosom ein Stopkodon erkennt und gleichzeitig mindestens ein EJC ausreichend abwärts (in Richtung 3’ Ende) an diese mRNA gebunden ist.
– NMD ist ein Qualitätskontrollmechanismus, der “Nonsense”-Mutationen in mRNAs
erkennt, die 50-55 nt “upstream” von einer Exon-Exon-Verbindungsstelle liegen.

Answer 27

Richtig:
– NMD ist ein Qualitätskontrollmechanismus der Zelle, welcher im Zytoplasma der Zelle stattfindet und abhängig von mRNA-Translation ist.
– NMD wird aktiviert, wenn ein translatierendes Ribosom ein Stopkodon erkennt und gleichzeitig mindestens ein EJC ausreichend abwärts (in Richtung 3’ Ende) an diese mRNA gebunden ist.
– NMD ist ein Qualitätskontrollmechanismus, der “Nonsense”-Mutationen in mRNAs
erkennt, die 50-55 nt “upstream” von einer Exon-Exon-Verbindungsstelle liegen.

Question 28

Nennen Sie 3 Elemente in prä-mRNAs, deren Mutation zu genetischen Erkrankungen bei
Menschen führen kann.

Answer 28

Ist die Frage so gemeint?:
Cryptische Spleißstellen
nonsense Mutationen -> PTC oder Erzeugung/Zerstörung Spleißstelle
Leserasterverschiebung durch alternatives Spleißen

Vielleicht auch ESE, ESS etc., Poly(A)-Signal, USE?

Question 29

Alternatives Spleißen wird zusätzlich durch ein antagonistisches Zusammenspiel von aktivierenden und inhibierenden Proteinfaktoren reguliert. Welche Faktoren sind dies? Welche Spleiß-spezifischen RNA-Sequenz-Elemente werden bevorzugt von diesen gebunden?

Answer 29

hnRNPs binden Exonische/Intronische Spleißsilencer (ESS/ISS)
SR Proteine binden Exonische/Intronische Spleißenhancer (ESE/ISE)

Ausführlicher???