Растителни in vitro системи. Клетъчни суспензии. Flashcards
Същност на технологиите за получаване на БАВ от растителни in vitro системи
Сложен и многоетапен процес, целящ максимални добиви. Изискват задълбочено изучаване на:
- генетичните, физиологичните и биохимичните особености за оптимизация и контрол на биосинтеза на целевия метаболит в изследваната in vitro система;
- връзките „растителна in vitro система - продукт”
- подходящ дизайн на използваните биореактори.
Обща схема на Биосинтез на вторични метаболити от растителни in vitro системи
Растение -> Стерилен експлант -> калус/култури от прорастъци/трансформирани коренови култури -> ПРОДУКТ
или
Растение -> Стерилен експлант -> Калус -> култури от прорастъци/трансформирани коренови -> ПРОДУКТ
Определение за “експлант”
Малко парче от млада растителна тъкан (листа, корени, листни пъпки, луковици, стебла, семена, апикални меристеми), което се използва като първичен материал за получаване на различни видове растителни in vitro системи. Размерът му зависи от растителния вид.
Как да подберем ХС за получаване на калус от нашия експлант?
Литературна справка, а ако липсва информация, използваме някоя от стандартните среди (MS, LS, B5 или SH), след което трябва да подберем и схема с различни концентрации на растежни регулатори (комбинации ауксини:цитокини) - поне 5 концентрации на ауксини и 5 концентрации на цитокини. Невинаги е възможно получаването на калус, колкото и комбинации да опитваме!
Етапи при получаване на калус от експлант
- Избор на експлант
- Избор на ХС
- Стерилизиране на експланта
- Посев на различни експланти за получаване на калус - препъръчително е повърхността на експланта да е прорязана неколкократно
- Поставяне във фитокамера при подходяща Т (26-28 C) и осветление (16/8=светло/тъмно фотопериод)
- Генериране на калус - въздушен (friable) или компактен (non-friable)
- Отделяне на калуса от експланта и прехвърляне на свежа ХС
Как се стерилизират експланти?
- Предварителна обработка – промиване с течаща вода за повърхностно почистване, особено за органи от под почвата;
- Двустепенна стерилизация:
2.1. третиране с 70% етанол за 10-30 сек. и ПАВ (tween 20, tween 40. осигуряват по-добър контакт със стерилизиращия агент, редуцирайки повърхностното напрежение)
2.2. третиране със стерилизиращ агент: натриев хипохлорид, калциев хипохлорид за 10-20 мин., живачен дихлорид за 10-30 мин., сярна киселина до 90% за 1-5 мин. (за семена), антибиотици (амфотерицин, ампицилин, пеницилин, клафоран, но не са достатъчно надеждни)
Определение за “калус”
Неорганизирана маса от делящи се паренхимни клетки, получени от растителни експланти за използване в изследвания в областта на биологията и биотехнологиите.
Какъв растителен материал е най-подходящ за получаване на ВМ и защо?
Растителни клетъчни суспензии, защото, подобно на МО, могат да се култивират в големи обеми, използвайки биореактори, подходящи и за микробни ферментации.
Определение за “клетъчни суспензии”
Популации от единични клетки и клетъчни агрегати (от 4-5 до 100), суспендирани в течна среда.
Как се получават растителни клетъчни суспензии от въздушен калус?
Най-лесна процедура: калусът (50% инокулум) се прехвърля на течна ХС и се култивира дълбочинно на клатачка (100-150 rpm). За получаване на стабилни клетъчни суспензии са необходими 4-5 субкултивирания (с по 10-20% инокулум), след което може да се използва за инокулиране на малки БР и по-нататъшно мащабиране.
Как се получават растителни клетъчни суспензии от компактен калус?
Да се разруши калусната тъкан и да се получат единични клетки - най-добре чрез мека ензимна хидролиза с пектиназа или Macerozyme R10 (комплекс пектинази и целулази от Aspergillus). Условията на процеса се определят експериментално. *ако ензимът е прекалено концентриран, ще се разрушат клетките
Пасажиране на клетъчни суспензии
Стерилно прехвърляне на свежа среда. Налага се по-често, отколкото при калусните култури. Да се използва подходящ размер инокулум - колкото по-малък е, толково лаг-фазата е по-дълга, а ако е под определено критично ниво, клетките не растат, т.к. в началото на култивирането се нуждаят от определени метаболити, синтезирани от самите тях по време на предходния култивационен цикъл.
Определение за “клетъчна култура”
Култура от единични, нарастващи в ин витро условия, клетки, които не са организирани под формата на тъкани.
