Животински клетъчни култури

Question 1

Как се получават животински клетъчни култури?

Answer 1

От тъканни експланти. Могат да се култивират като тъканни култури или клетъчни суспензии.

Question 2

Области на приложение

Answer 2

1. Имунология
2. Геномика
3. Тъканно инженерство
4. Токсикология
5. Взаимодействие клетка-клетка
6. Фармакология
7. Intracellular flux
8. Intracellular activity

Question 3

Определение за “Клетъчно клониране”

Answer 3

Получаване на колония от единична клетка. При субкултивиране се получава клетъчен щам (линия).

Question 4

Определение за “Клетъчна линия”

Answer 4

Субкултивирана първична култура. Клетъчната линия може да бъде с ограничен или непрекъснат (продължителен) живот.

Question 5

Определение за “Клетъчен щам”

Answer 5

Клетъчна линия, пречистена чрез физично разделяне, селекция или клетъчно клониране.

Question 6

Определение за “Клетъчна линия с непрекъснат (продължителен) живот”

Answer 6

Неопределена пролифирация. Това състояние на клетъчната линия може да се индуцира чрез трансфер на вирусен ген или е предварително придобито от няколко ракови клетки преди култивиране.

Question 7

Определение за “Първична култура”

Answer 7

Прясно изолирана култура до първия пасаж на субкултивиране.

Question 8

Определение за “Серум”

Answer 8

кръвна течност без клетки и съсирващи фактори

Question 9

Определение за “Суспензионна култура”

Answer 9

Клетки, развиващи се независимо една от друга в течна хранителна среда.

Question 10

Определение за “Клетъчна култура”

Answer 10

Култура от единични, нарастващи клетки, които не са организирани под формата на тъкан. Клетъчните култури, които се състоят от отделни клетки, загубват характерната организация и свързаните с нея биохимични особености, което не позволява те да бъдат използвани в процеси, характерни за тъканите и органите. Този тип култури, обаче са подходящи за изследвания на клетъчно ниво.

Question 11

Определение за “Тъканна култура”

Answer 11

Общоприет термин за култивиране на животински клетки. Фрагмент от тъкан, отглеждана в in vitro условия, които позволяват диференциране и запазване на тъканната архитектура и/или тъканни функции.

Question 12

Определение за “Органна култура”

Answer 12

Култура от органни зачатъци, части от орган или цял орган, поддържани или нарастващи в условия ин витро, които позволяват диференциране и запазване на архитектурата и/или органните функции.

Question 13

Предимства на животинските тъканни култури

Answer 13

• Контролирани условия на култивиране
• Хомогенност на експерименталните пробите
• Възможност за автоматизация и мащабиране
• Ин витро моделиране на ин виво условията

Question 14

Недостатъци на животинските тъканни култури

Answer 14

• Лимитирано познание и обучен персонал
• Количество на култивираните клетки при ин витро условия
• Нестабилност на получаваните клетъчни линии
• Достъпност до подходящи експланти
• Промяна на свойствата при дедиференциация на тъканите

Question 15

Видове тъканни култури

Answer 15

1. Органови култури - притежават структурните характеристики на тъканта, от която са получени. Култивират се на граничната повърхност между хранителната и въздушната среда.
2. Култура от първични експланти – фрагмент от тъкан се поставя на повърхността на хранителната среда, след което мигрира в твърдия субстрат.
3. Клетъчна култура – тъканна култура или прорастъци от първични експланти се суспендират, механично или ензимно, в течна ХС, при което се получава клетъчна суспензия, която впоследствие може да бъде култивирана като монослой на твърда хранителна среда или като суспензия в течна ХС.

Question 16

Етични норми за работа с животински тъкани

Answer 16

Всички европейски страни имат национално законодателство, което регулира етичните въпроси за работа с животински тъкани. Регулациите се отнасят до „висшите“ животни, тези които имат достатъчен мозъчен капацитет, за да чувстват болка или да изпадат в стрес и не се отнася до такива, които не притежават такива способности, например рибите. Рестрикциите се отнасят до методите на умъртвяване, методите на екстракция на ембриони или тъкани, определят условията, при които се отглеждат животните, и експерименталните условия, при които се поставят. Контролът се осъществява от независими етични комисии.

Question 17

Етични норми за работа с човешки тъкани

Answer 17

Условията за работа с човешки материал са по-стриктни и по-комплексни. Тъканите трябва да се екстрахират при клинични условия, от опитен медицински интервенист. Разрешението за работа с човешки материал се изисква от специално формирана етична комисия, а контролът по самата работа се осъществява от етична комисия на болничното заведение. Основният въпрос, който стои открит към момента е собствеността на материала, неговото ДНК, както и продуктите с комерсиална стойност, които се получават в следствие на проведените изследвания.

Question 18

Задължителни аспекти при работата с човешки материал

Answer 18

1. Информирано съгласие за взимане на проби тъкан от пациентите или техни роднини (ако пациента не е в състояние) - писмено, във форма, разбираема от всички страни;
2. Към документите трябва да е налично кратко описание на проекта, в който ще се работи с човешкия материал;
3. Конфиденциалност на произхода на материала;
4. Ясно да се определи собствеността на материала, тъканната култура и продуктите на научното изследване;
5. Специално разрешение от съответната Национална етична комисия в случай на генетични модификации;
6. В случай на комерсиализиране на продуктите от изследването е необходимо сключване на договор с донора на материала;
7. Донорът определя дали желае да му бъде предоставяна генетичната информация, получавана в следствие на експеримента.

Question 19

ХС в зависимост от произхода

Answer 19

1. Естествени
2. Изкуствени
3. Смесени

Question 20

Естествени ХС

Answer 20

1. Тъканни и ембрионални екстракти - избрана тъкан се хомогенизира в равен обем физиологичен буфер, центруфугира се и получената супернатанта се използва за клетъчното култивиране;
2. Телесни течности - кръвен серум (най-често; за предпочитане от ебриони или млади животни, съдържа по-високи концентрации от растежни фактори), плеврална течност,амниотична течност, стъкловидно тяло на окото и т.н.

Question 21

Недостатъци на естествените ХС

Answer 21

• непостоянен състав
• съдържат токсини
• често са контаминирани с МО
• скъпи

Question 22

Предимства на изкуствените ХС

Answer 22

• дефиниран състав
• намален риск от контаминация
• по-евтини
• лесно пречистване на продуктите от културата
• продават се готови за употреба - стерилни

Question 23

Недостатък на изкуствените ХС

Answer 23

• осигуряват кратък живот на културата, ако не се добави серум: всички животински клетки се нуждаят от растежни фактори, каквито се съдържат в серума - добавянето на 5-10% към изкуствените среди подобрява значително преживяемостта на културата.

Question 24

Примери за изкуствени ХС

Answer 24

1. Основна среда на Игъл (ВМЕ) - соли, глюкоза, 12 АК, витамини, без които култивирането е невъзможно; създадена за култивирането на HeLa (човешки карцином) и L (миши фибробласти) клетки;
   1.1. Деривати на ВМЕ:
   - Минимална есенциална среда на Игъл (ЕМЕМ) - с по-високи концентрации на основните компоненти;
   - Дюлбекомодифицирана среда на Игъл (DMEM) - АК х4, + други АК и витамини;
2. RPMI (Roswell Park Memorial Institute) среди - на базата на ВМЕ и DВМЕ средите, но с по-богат състав по отношение АК и витамините. Използват се за „по-трудни“ клетки и са значително по-скъпи;
3. Други среди - разработени за
   конкретни клетъчни типови, от други автори и носещи техните имена (среда на Фишер за миши левкемични клетки в суспензия, среда на Лайбовиц за човешки диплоиднифибробласти, среда Е на Уилям за продължително отглеждане на зрели хематоцити от плъх);
4. Среди за поддържане на клетките без добавка на серум - комплексни, съдържат микроелементи, липиди, източници на желязо и др.;

Question 25

Какво представляват смесените ХС?

Answer 25

Изкуствени ХС с добавка на 5-20% серум. Най-широко използвани. Осигуряват неограничено дълго поддържане на клетъчния растеж.

Question 26

Каква е ролята на серума, добавян в смесените ХС?

Answer 26

1. Доставя хормонални фактори, стимулиращи клетъчния растеж и функции - растежни фактори в нано- и субнано- концентрации, хормони (инсулин във високи концентрации, поради краткия му полуживот, глюкокортикоиди, стероидни хормони, тироидни хормони и др.) 2. Подпомага прикрепването на клетките и доставя фактори за разстилането им върху субстрата - фактори като витронектин, фибронектин и др. 3. Доставя транспортни белтъци, пренасящи хормони, липиди, минерали и т.н. – албумин, трансферин.

Question 27

Кой е основният недостатък на тъканните и органови култури?

Answer 27

Ограниченият период на отглеждането им ин витро

Question 28

Видове клетъчни култури според начина, по който изолираните клетки нарастват в лабораторния съд

Answer 28

Монослойни и суспензионни

Question 29

Видове клетъчни култури според времето, за което една клетъчна линия може да бъде отглеждана при ин витро условия

Answer 29

- Първична клетъчна култура - Клетъчна линия (вторична клетъчна култура) - Непрекъсната клетъчна линия

Question 30

Характеристика на монослойните клетъчни култури

Answer 30

Култури, при които клетките нарастват заловени за дъното на лабораторния съд под формата на единичен слой от клетки. Нуждаят се от свободно пространство, за което да се захващат новообразуваните клетки - ако клетките запълнят цялото пространство, те спират да се делят, независимо от наличието на ХС, поради контактно инхибиране (не се наблюдава при раковите клетки) -> необходимо периодично препосяване. Клетките обикновено загубват типичната морфология на тъканите, от които произхождат, поради трансформация и адаптация към новите условия на средата.

Question 31

Характеристика на суспензионните клетъчни култури

Answer 31

Култури, при които клетките или малки агрегати от клетки, нарастват свободно при дълбочинни условия на култивиране в течна ХС. Независим растеж от контакт с лабораторния съд. В повечето случаи са раково трансформирани и не притежават контактно инхибиране.

Question 32

Превръщане на монослойните култури в суспензионни

Answer 32

1. Чрез адаптация - разрушаване на монослоя на отделни клетки чрез третиране с трипсин и култивиране на клетките в среди, свободни Ca и Mg йони при постоянно разбъркване. Ако се наблюдава агрегиране на клетките, към средата се добавя трипсин в ниска концентрация. Успешна адаптация - постоянно нарастване на концентрацията на култивираните клетки. 2. Чрез селекция - многократно отделяне от монослойната култура на клетки, които са по-слабосвързани;

Question 33

Характеристика на първична клетъчна култура

Answer 33

Култура от клетки, взети директно от организма и преживели в условия ин витро за повече от 24 часа, се означава като първична, а клетките които я образуват се наричат първични клетки. Водят началото си от нормални, ембрионални или ракови тъкани (най-лесно от ембрионална култура).

Question 34

Етапи при получаване на клетъчни култури от миши ебриони

Answer 34

1. Стерилизиране с етанол и одиране на обекта 2. Отваряне на утробата 3. Отваряне на матката и екстракция на ембрионите 4. Отделяне на ембрионите от плацентата 5. Нарязване на ембрионите 6. Прехвърляне на парченцата директно на подходящи ХС или допълнителна обработка с трипсин, или механично разрушаване, за получаването на единични клетки, които след това да се отделят и посеят на подходящи ХС. 7. След иницииране на първичната култура от единични клетки, ХС се сменя след 24 часа, тъй като клетките, които не са се захванали за дъното на съда не са жизнеспособни. След това средата трябва да бъде заменяна на всеки 3 дни.

Question 35

Характеристика на вторичната клетъчна култура (клетъчна линия)

Answer 35

Култура от клетки, получена след първото субкултивиране на първичната клетъчна култура. При достигане на плътен монослой, първичната клетъчна култура трябва да бъде пресята (субкултивирана) в нови съдове с цел да се осигури следващото размножаване. При суспензионните култури маркер за субкултивиране е киселинността на средата. Ако рН пада бързо след добавянето й, те трябва да се субкултивират, защото това е маркер за постигане на граничната концентрация.

Question 36

Какви селекционни подходи се използват за изчистване на вариациите след субкултивиране?

Answer 36

- селективна обработка с ензими; - трансплантация (редуване на ин витро с ин виво култивиране чрез обратно инжектиране в лабораторните животни, този цикъл на култивиране се повтаря многократно до изчистване на клетъчната линия); - хроматография в зависимост от свойствата на клетъчната повърхност (свързване на клетките с антитяло, предварително имобилизирано на инертна матрица, напр. стъклени или пластмасови минисфери, антитялото с лиганда се нанася в колона, през която се пропуска клетъчната суспензия); - градиентно центрофугиране - разделяне по големина; - проточен цитометър; - клониране - получаване на клетъчна линия от една единствена клетка, в най-голяма степен гарантира хомогенността на получената клетъчна линия!

Question 37

Какво представлява програмираната клетъчна смърт или клетъчно остаряване?

Answer 37

След определен брой клетъчни цикли, клетките в линиите започват да отмират, независимо, че клетките остават нормални (диплоидни) и не показват злокачествени изменения. Общовалиден процес за всички клетъчни линии, изолирани от нормални тъкани на гръбначни животни. След около 6 месеца нарастването на клетките в културата намалява, а след около 10 месеца, клетките дегенерират и загиват. Този феномен е в основата на означаването на този тип клетъчни култури като крайни (с ограничен живот).

Question 38

Определение за "криза" на клетъчната линия

Answer 38

Периодът, през който клетъчната линия показва намалена степен на пролиферация. Възможно е малък брой клетки да преживеят в резултат на ин витро трансформация и да дадат началото на култура, която е в състояние да преживее ин витро безкрайно дълго време.

Question 39

Определение за непрекъсната клетъчна линия

Answer 39

Клетъчна линия, образувана от трансформирани клетки, които имат способността да се развиват при ин витро условия неограничено дълго време. Клетките от непрекъснатите клетъчни линии обекновено загубват характеристиките на тъканите, от които произхождат. Те най-често са анеуплоидни.

Question 40

Как се осъществява ин витро трансформацията за получаване на непрекъснати клетъчни линии?

Answer 40

Спонтанно или чрез обработка с химични канцерогени, облъчване, трансфекция с онкогени или заразяване с онковируси.

Question 41

По какво се различават ин витро трансформацията и раковата трансформация?

Answer 41

При обратно инжектиране на ин витро трансформираните клетки в лабораторни животни, не винаги се образуват тумори. Когато клетъчните линии произхождат от ракови тъкани, те са непрекъснати, като трансформацията е протекла още в тъканите на многоклетъчния организъм.