Проточна цитометрия Flashcards
Определение за “проточна цитометрия”
Метод за анализ на единични клетки в поток.
Принцип на проточната цитометрия
Измерване на разсеяната,
отразената светлина и флуоресценцията. Обикновено се мери разсеяната светлина под два различни ъгъла и флуорестценцията при няколко дължини на вълната (един до шест канала).
Приложение на проточната цитометрия
за измерване и анализ на бактерии, дрожди, микроводорасли, животински и растителни клетки, а също и по-малки частици – вируси, хромозоми и др.
Как се осигурява флуоресценцията на клетките?
Флуорасцентни агенти се използват за маркиране на клетъчни компоненти – ДНК, белтъци (чрез прикрепяне на
флуоресциращи антитела). Някои организми, като микроводораслите, притежават автофлуоресценция.
Основни предимства на проточната цитометрия
- Анализ на голям брой обекти за кратко време (100 000/1сек и до 20 параметъра) -> статистическа достоверност;
- Възможност за разделяне на популация от клетки на съставящите я типове (до 70 000 частици/1 сек) с висока чувствителност (дори при честота на клетките 1:100 000);
- Може да протича при стерилни условия.
Основен недостатък на поточната цитометрия
Необходимост от получаване на суспензия от единични частици - сдвояването на клетките изкривява резултатите.
Как се представят данните?
- Еднопараметрови хистограми;
- Двупараметрови корелационни плотове (цитограми) - точкови плотове ( всяка точка представя една единична клетка), като линии или като хистограми
Определение за “хистограма”
Числови данни, групирани в “интервали” с еднаква широчина. Данните за всеки интервал се нанасят като стълб, чиято височина съответства на това колко точки с данни има в него.
Принципна схема на цитометър (апаратура)
Източник на светлина -> проточна камера -> оптична система -> светлинни детектори -> компютър
Какво представлява проточната камера?
Това е основата на апарата. В нея се създават условията за
получаване на ламинарен поток от единични клетки. Нейната основна функция е да осигурява единични клетки в момента на измерването. Обикновено е изработена от кварц.
Как става хидродинамичното фокусиране на пробата в проточната камера?
Пробата се инжектира в центъра на поток от вода или буфер (фокусиращ флуид). Създава се ламинарен коаксиален (с обща ос) поток с общ диаметър 10 микром. Пробата и флуидът не се смесват поради ефекта на Бернули и частиците се ориентират към областта с понижено налягане. В момента, в който потокът е стабилизиран се фокусира и светлината върху анализираните частици.
Какво гласи принципът на Бернули?
За невискозен флуид, увеличението на скоростта на потока е придружено винаги или с намаляване на налягането, или с намаляване на потенциалната енергия на флуида. Извежда се от Закона за запазване на енергията: във всяка точка от дадена токова линия сборът от всички енергии е константа. Оттам увеличение на скоростта на флуида води до увеличаване на кинетичната енергия, следователно до намаляване на налягането или потенциалната енергия.
Елементи на флуидната система
- Система за създаване на налягане - въздушни компресори, задвижващи фокусиращия флуид и пробата през проточната камера. Скоростта се регулира чрез налягането - може да бъде променлива или фиксирана на три нива – ниска, средна и висока;
- Система за вакуум - при почистване на апарата.
Какви източници на светлина се използват?
- Твърдофазни лазери - предпочитани т.к. произвеждат монохроматична светлина и висок интензитет и са много малки; най-често син (488 нм - подходяща за флуоресценция при флуоресцеина – най-широко
използваната флуорцентна боя), още 355, 375 nm – UV, 405 nm –виолетов, 561 nm – зелен, 640 nm - червен; ако се използват светлинни източници, различни от лазерите е необходимо и използването на филтри за получаването на монохроматична светлина. - LED лампи
Мощност на използваните лазери
10 и 25 mW, но се появяват на пазара и такива, емитиращи 200 mW. По-висока мощност на излъване = по-добра чувствителност. По-малки по размер частици -> толкова по-мощен трябва да е лазерният светлинен източник.
Оптични елементи на поточния цитометър
1) Блокер на преминалата лазерна светлина - срещу лазера с цел измерването само на разсеяната светлина; зад блокера е разположен фотоумножителя и детектора на разсеяната под малък ъгъл светлина (FSL);
2) Серия от монохроматични огледала - селектират светлинни потоци с различна дължина на вълната, отразяват светлина с определена дължина и пропускат останалата част от светлинния поток;
3) Система лещи - осигуряват диаметър на потока от 50 µm - от особено значение за правилното фокусиране на лазерния лъч върху ламинарния поток от анализираните единични частици.
Какви детектори се използват в проточните цитометри?
Фотоумножители с подходяща чувствителност за определената дължина на вълната.
Сигнал, генериран от преминаването на частицата през лазерния лъч
Генерираният от измерването сигнал е пик с височина, ширина и площ:
1) ако ширината на лазерния лъч е по-голяма от диаметъра на частицата, височината на пика ще бъде характеристична на общата флуоресценция на частицата;
2) ако лъчът е по-тесен от диаметъра на частицата, само част от нея ще бъде облъчена по време на преминаването през лъча и получената информация нямя да е характеристична.
Варианти за размерност на цитограмите
1) линейна - за анализ на клетъчния цикъл, с използване на ДНК оцветяване;
2) логаритмична - при имунофлуоресценцията;
Преминаването от линейна към логаритмична размерност има ефект на компресиране на данните и положителната информация става по-ясно видима.
Как става разделянето на клетки?
1) на база отклонение на заредени капки - използва се зареден фокусиращ флуид (най-често буфериран физ р-р), проточната камера вибрира вертикално (20-60 Hz), като вибрацията се предизвиква от пиезоелектричен прекъсвач и нарушава потока на флуида - образуват се капчици на изхода на камерата - камерата и флуида се зареждат в момента, в който преминава частицата; потокът със заредени частици преминава през заредени електроди и така заредените и незаредените частици се дистрибутират; при идеални условия клетките се разделят с честота по-висока от 98%.
2) пиезоелектрични устройства за механично разделяне - за по-големи частици, не са високопроизводителни (до 300част/1мин), но са много стабилни и не изискват допълнително калибриране или настройване.
Работни характеристики на проточния цитометър
1) Чувствителност - определя се или от прага на измерваната флуоресценция, или от нейната резолюция;
2) Праг на измерваната флуоресценция - определя се от най-ниския сигнал, създаден от флуоресциращите частици, който предизвиква промяна на измерваните параметри;
3) Резолюция - степента, до която инструмента може да различи нефлуоресциращи или слабофлуоресциращи частици в смес.
Определение за “флуоресценция” като физично явление
Когато един компонент абсорбира светлина (енергия) електроните преминават от основно състояние във възбудено. Електроните се връщат в основно състояние чрез различни преходи, които могат да включват емисията на кванти светлина. Този преход е известен като флуоресценция. Емитираната светлина винаги ще бъде с по-ниска енергия и следователно с по-голяма дължина на вълната. Енергия се губи и при преход без излъчване на светлина, а на топлина.
Абсорбция и емисия на светлина при флуоресценция - принцип
След възбуждането електронът преминава на възбудено ниво с по-ниска енергия, след което се мести на основно ниво и емитира светлина. Поради това, че цветовете на възбуждащата и емитираната светлина са различни, те могат да бъдат разделени чрез оптични филтри. Детектирането на компоненти, флуоресциращи при различна дължина на вълната позволява многопараметрични анализи. Повечето цитометри измерват до 4 флуоресцентни канала.
Свойства на различните флуорохромите
- Пропидиев йодит - използва се за оцветяване на ДНК, има слаба флуоресценция във водна среда, но в хидрофобна среда флуоресциращата му способност се увеличава 50х;
- Флуоресцеин - чувствителен към рН на средата;
- Други - чувствителни към наличието на определени йони в средата.
Групи флуоресцентни бои, използвани в проточната цитометрия
1) свързващи се нековалентно с анализираната структура;
2) свързващи се ковалентно с анализираната структура;
3) флуоресцетни белтъци
Примери за флуорохроми за белязане на белтъци
- флуоресцеин изо тиоцианид - изотиоцианидната група се свързва с Lys остатъци - най-често използван;
- предварително белязани моноклонални антитела.
Примери за флуорохроми за белязане на НК
Свързват се стехиометрично с НК и могат да се използват за количественото им определяне. Това е базата за анализа на плоидността и клетъчния цикъл:
- DAPI - маркиране само на ДНК при облъчване с УВ; изисква пермебиализация на КМ; количествено определяне на НК;
- aнтрахинонът DRAQ5 (макс А=646 nm, но и при син лазер), и бис-бензимадазолите (Hoechst 33342, свързва се с А-Т богатите региони на ДНК и флуоресцира синьо, когато се облъчи с UV) - преминават интактните клетъчни мембрани; анализ на клетъчния цикъл на живи клетки и на антимикробна активност;
- пропидиевият йодит (PI) - най-използваната боя за ДНК; вгражда се между базите на дв; възбужда се от синя светлина и флуорецсира в червено; комбинация с флуоресцеин + син лазер -> успореден анализ на количеството ДНК и белтъци, белязани с антитела; *свързва се и с РНК -> да се отстрани предварително с РНКази; нативните КМ не пропускат PI и поради това преди оцветяване клетките трябва да бъдат фиксирани.
Пример за флуоресцентен белтък
Зеленият флуоресциращ белтък (GFP) абсорбира при 488 nm и флуоресцира зелено. За разделяне на клетките и за анализ на патогени.
Какви изводи могат да се направят от анализа на ДНК съдържанието на единични клетки?
За плоидността, анализ на туморни клетки, анализ на клетъчния цикъл.
Кои елементи от процедурите по оцветяване подлежат на оптимизация?
Времето на инкубиране с оцветителя;
Концентрацията на боята;
Условията на фиксиране и пермеабилизиране.
Типове плоидност
1) хаплоидност (n) - броят на хромозомите в гаметите;
2) диплоидност (2n) - броят на хромозомите в соматичните клетки;
3) тетраплоидност/октаплоидност - броят на хромозомите в някои соматични клетки при растенията;
4) анеуплоидност - ненормалният (различен от 2n) брой хромозоми - над 2n
(хиперплоидни) и или по-малко (хипоплоидни) при раковите клетки - рефлектира, при анализ, в различно количество ДНК в клетките.
Какво представлява ДНК индексът (DI) на туморите?
Съотношението между съдържанието на ДНК в туморните клетки и в съответните нормални диплоидни клетки.
Какъв вътрешен стандарт често се използва при анализа на тумори?
Пилешки или рибни (най-често от пъстърва) еритроцити.
Съдържанието на ДНК в тези клетки е по-малко от това на
човешките диплоидни соматични клетки.
Какво представлява “ендоредупликацията”?
Репликация на ядрения геном без ядрено и клетъчно делене, което води до полиплоидност.
Как се определя качеството на ДНК цитограмите?
Чрез коефициент на вариациите (CV) на широчината на пиковете на клетките в G1 фаза /чрез стандартното отклонение/:
CV, % = 100 x SD
SD - средна стойност на каналите на пиковете;
по-ниско CV - по-точно измерване количеството ДНК, възможно да е под 1%, но най-често е около 2% при животински клетки и 3% при растителни.
Кои са ключовите елементи за получаването на качествени цитограми?
1) пробоподготовка - да се получи суспензия от единични клетки с минимален брой сдвоени частици; частиците да бъдат количествено оцветени, което е в пряка връзка с концентрацията на използваната боя и времето на
оцветяване;
2) настройване на апарата - работата на апарата да се
провери чрез използването на калибрирани флуоресциращи частици, за които е известно какъв CV дават; ако е необходимо се коригират силата на лазера и другите параметри до достигане на стандартната стойност на CV.
Как апаратът изключва групираните частици от анализа?
Широчината на лазерния лъч е съобразена с размера на анализираните частици. Така например размерът на сдвоените клетки и клетъчни ядра, намиращи се в G1 фаза е двоен на нормална клетка в G2 фаза, или размерът на сдвоени ядра в G1 фаза е 75% по-голям от този на ядро в G2 фаза.
Кои са най-използваните софтуери на пазара, специално разработени за анализ на ДНК и клетъчен цикъл?
ModFit (VeritySoftware) и Multicycle (PhoenixFlowSystems). Решават проблема с препокриването на клетки, държащо се на отклонения при оцветяването и при физическото измерване в апарата.
Как се осъществяват мултипараметрични анализи?
Понякога разсейването на светлината разкрива допълнителна информация, която е от полза за анализа на съответните параметри и отделянето на различни популации.
Как могат да бъдат измерени оксидативните процеси в клетките?
Чрез използване на в-ва, които флуоресцират само в окислена форма:
- дихидродамин 123 - концентрира се в митохондриите и флуоресцира в зелено;
- дихидроетидиум - свързва се с ДНК и флуоресцира в червено;
- DCFH - вкарва се в клетките като естер и след трансформация от вътреклетъчните естерази флуоресцира;
Други приложения на проточната цитометрия
1) измерване на вътреклетъчната концентрация на Ca2+ или на глутатион;
2) измерване на рН - с бои, чиято дължина на вълната на
флуоресцентната емисия е рН – зависима;
3) измерване абсорбцията на лекарства;
4) анализ и сортиране на хромозоми;
5) количествен анализ на РНК;
6) придвижване на клетките в тъканите;
7) мониторинг на електропермебиализацията;
8) идентифициране на стволови клетки;
9) анализ на антимикробна активност;
10) в хранително-вкусовата промишленост;
Примери за приложение на проточната цитометрия В ХВП
1) анализ на патогенни МО чрез имунофлуоресценция (Salmonella);
2) замърсяване на млечни продукти и плодови сокове с дрожди;
3) анализ на Brettanomyces във вино и бира (влошават вкусовите качества, да се поддържат ниски нива), базиран на имунофлуоресценция;
4) млечна промишленост - лизис на ферментиращите бактерии, жизнеспособност на стартерните култури, съотношение на бактериите в стартерните култури, контрол на бактериофагите в апаратите;
5) анализ на произхода на пчелния мед чрез анализ на ДНК полените.
Каква информация за клетките ни дават параметрите FSC & SSC?
FSC (forward scattered light, светлина, отклонена на малък ъгъл) = размер на клетките - по-големите клетки дават по-голям FSC;
SSC (side scattered light, светлина, разсеяна на 90о) = грануларност (съдържание на различни молекули и органели в клетката) - по-висока -> по-голям SSC;
