Immunologi Flashcards
Varför tar man så många glas av samma vävnad på immun?
Man vill kunna färga in med flera olika antikroppar
Hur många snitt tar man per glas?
3 st
Vad är skillnaden på glasen som används på immun jämfört med andra glas?
De är laddade, vilket gör att snitten fäster bättre
Varför grovsnittar man inte på immun? Och varför tar man alla snitt man får?
På immun kommer det främst efterbeställningar, klossen kommer alltså redan vara snittad på. I och med att man redan snittat och man ska ta så många glas så har man inte råd att snitta bort massa vävnad i onödan. Det kanske inte finns så mycket kvar i klossen
Vilken tjocklek snittar man på?
3,5 um (2,5 på transplantation, njure)
Ett snitt ska man göra tjockare. Varför och hur tjockt?
Det ska vara 7 um för att det är en viss färgning som kräver det. Blir inte bra annars.
Hur bränns immunglas? Varför?
60 minuter i 60 grader
Måste brännas ordentligt så att de klarar prepareringen
Varför har man kontroller på alla glas?
Alla glas i ett fall färgas individuellt med olika antikroppar. För att försäkra sig om att varje färgning blivit bra behöver alla glas ha en kontroll
Vad är nackdelen med de laddade glasen
Även vatten kommer sitta hårdare på glasen under snitten. Viktigt att man läskar glasen ordentligt innan bränning.
Vad sker i PT-link?
- Glasen avparaffineras
- Metylenbryggorna bryts
Hur bryts metylenbryggorna i PT-link?
Genom värme då glasen kokas och genom antingen högt (9) eller lågt (6) pH på bufferten
Varför vill man bryta metylenbryggorna?
För att öppna upp epitopen för antikroppar att kunna binda in till senare
Vad för alternativ prepareringsmetod finns?
Med mikrovågsugn. Man har antingen citrat (pH 6) eller EDTA (pH 9).
Med denna metod måste man dock avparaffinera först
I vilka fall vill man använda preparering med mikron?
Det är en lite snällare metod, kan användas om man har lite extra känsliga vävnader
Vad är Autostainer?
Automatiserad färgningsmaskin.
Använder polymerbaserad immunhistokemi
Vilka är stegen i polymerbaserad immunhistokemi
- Peroxidasblock
- Primär antikropp
- Linker (inte alltid den behövs)
- Sekundär antikropp med pelymerkedja och peroxidas
- DAB
- Hematoxylin
Varför använder man peroxidasblock?
Kromogenet DAB binder in till peroxidas. Vi har lite persoxidas naturligt i vävnaden. Detta behöver blockas så att man inte får en ospecifik infärgning
Varför använder man ibland en linker?
Om man har en svag antikropp kommer linkern att förstärka så att man ändå kan se någon färgning.
Kan binda in flera sekundära antikoppar
Vad är HRP?
Horseradish peroxidas
Det ör hela komplexet med sekundärantikroppar, polymerkedja och peroxidas
Varför har man flera olika sekundärantikroppar på polymerkedjan?
Så att man inte ska behöva ha en specifik sekundärantikropp till varje primärantikropp. Man kan använda samma till alla oavsett sort.
Vad gör DAB?
Det är kromogenet. Ett enzym som reagerar med peroxidaset och ger en brun färg
Varför färgas man med hematoxylin efter immunfärgningen?
För att få en bakgrundsfärg och så att man ser även den vävnad som är negativ för just den antikroppen.
Blir blått.
Varför kan man vilja använda en annan kromogen än DAB?
Exempelvis myelom kommer få en brun färg. Då vill man inte att kromogenet också ska vara brunt då resultatet kan misstolkas. Man kan då istället använda ett rosa kromogen
Berätta om antikropp Ki-67
- IgG-antikropp från kanin
- Färgar in cellkärnor/nukleärt
- Tonsill som kontrollmaterial (germinala center där många B-celler delas)
- Nukleärt protein närvarande vid celldelning
- Bra markör för gradering av neoplasi i colon carcinom, bröst carcinom, lymfom och sarcom
