II Módszertan Flashcards
Kombinált teszt, hármas és négyes teszt
anyai életkor + UH (ülőmagasság, tarkóredő, súly, orrcsont nagyság) + vérvétel (ßhCG+ PPAP-A)
az esetek 85%-át ismeri fel és 5% fals pozitív. Nem diagnosztikus, hanem szűrő teszt -> rizikót becsül, de szélesebb körű chromoszóma abberációt vizsgál mint a NIPT
szabad-ß-hCG-értékek 1,35 MoM fölött, a PAPP-A-érték 0,6 MoM alatt, míg a tarkóredő vastagságának értéke 1,5 MoM fölött
Hármas teszt: AFP, hCG, ösztriol
Négyes tezst: AFP, hCG, ösztriol + inhibin
Eredmény:
Negatív: kockázat<1/1000
Köztes: kockázat 1/250-1/1000 között -> NIPT kell
Pozitív: kockázat > 1/250 -> CVS kell
NIPT
- Specifitás csak 13 Down, 13 Patau és 18 Edwards szindrómára magas a többire csak tájékozódó jellegű
- Magzati frakció, 12. hét előtt nem elég magas-> fals negatív / értékelhetetlen vizsgálat
- Fals pozitivtás okai:
○ Lepényre korlátozódó mozaicizmus
○ Wanishing twin
○ Anyai mozaicizus (életkorral nő a jelenléte)-> szintén ok h miért nem diagnosztikus, ezért kell 37+ kombi teszt is
○ Anyai daganat jelenléte
○ Anyai CNV (de novo v öröklött)
○ Transzplant: Csontvelő vagy szerv férfi donortól
○ Nem rég történt vér transzfúzió
○ Technikai hiba (gyakoriság: 1-2/1000) - Fals negativitás okai:
○ Lepényre korlátozódó mozaicizmus
○ Alacsony magzati frakció
○ Anyai CNV
Technikai hiba
Diszplázia, Malformatio, Disruptio, Deformitás
A fejlődést szabályozó gén(ek) mutációt szenvedhet(nek), így keletkezik a malformáció, amely a test egy részének (pld.: végtag) primer morfológiai defektusa; illetve a diszplázia, amely a sejtek szövetekbe szerveződésének károsodása során jön létre.
A normálisan elinduló fejlődést az embriógenezis későbbi szakaszában különböző külső tényezők károsíthatják, ide tartoznak a gyógyszerek (pld.: thalidomid, retinsav), kémiai anyagok, sugárzás, sérülés, infekció (pld.: varicella), vaszkuláris vagy metabolikus tényezők által kiváltott diszrupciós rendellenességek.
Szerzett eltérések közé soroljuk továbbá a mechanikai ártalom következtében létrejövő deformitásokat (pld.: intrauterin kényszertartás, oligohydramnion, beidegzési- motilitási zavarok)
Ezek súlyosságától függően beszélünk minor vagy maior anomáliáról.
Karyotipizálás menete
- Citrátos/Heparinos csőbe vér levétele
- Tenyésztés
Attól függően hogy leukaemiás/ crista bxből vagy perifériából származik a minta inkubáljuk
a. 25cm3-es flaskába tesszük a nem-kitapadó fehérvéjestek proliferációja 72h alatt mitogén (phitoagglutinin) hatására (periféria)
b. leukaemiás minta esetén 48h tenyésztés - Cholhicin hozzáadása -> metafázisban megállítja a sejteket
- Hypotonizálás KCl-el-> sejtek megduzzadnak és ckromoszómák kiszabadulnak
- Fixálás: Metil alkohol, ecetsav 3:1 arányú keverékékével
- Szuszpenziót tárgylemezre csöppentjük
- Tripszines emésztés
- G sávozás
a. Száradás után 5 %-os Giemsával megfesteni.
b. Metaphasisok mikroszkópos keresése, archiválás, komputeres metafázis értékelés.
Kb. 10-15-20 metafázis karyogram elkészítése
- Tenyésztés
Karyotpipzálás felhasználása
Klasszikus cytogenetika alapviszsgálata. Méret szerint sorba állított és festett kromoszómák (metafázis) fénymikroszkópos vizsgálata.
Az NGS módszerek terjedése ellenére ma is nagy a jelentősége, a veleszületett rendellenességek 5-7%-a detektálható vele. Diagnosztikus értékű a Down-, Edwards-, Patau-szindróma igazolása során. Továbbá felbontó képességének korlátait (5-10Mb) figyelembe véve képes a nagyobb kromoszómaszakaszokat (>3 Mb) érintő szerkezeti rendellenességek (transzlokációk, deléciók, duplikációk, inverziók) észlelésére, ezáltal a Wolf−Hirschhorn (4p-), cri du chat- (5p-), De Grouchy-szindróma (18q-, 18p-) detektálására. A kariotípus meghatározása elsődleges lépés ismeretlen eredetű alacsony növés, valamint nemikromoszómarendellenesség gyanúja esetén. A Turner-, Klinefelter-, dupla Y-, tripla X-szindróma nem mozaikos, vagy 20% feletti mozaikosságot mutató formáinak diagnosztizálásához elégséges a kariotípus meghatározása.
Karytopizálás során alkalmazott festések
G banding (Giemsa) – heterochromatikus, gén-szegény régiók sötétek
Heterochromatin AT gazdag, génekben szegény régió, jól
kondenzált -> sötéten festődik.
Euchromatin GC és Génekben gazdag, jól expresszálódik
-> világosan festődik.
R banding – reverse Giemsa
C-banding - Constitutív heterochromatin festés
T banding - telomer festés
FISH próbák típusai
- Centromera specifikus -> kromoszómák számbeli eltérése mutatható ki vele -> látszik ha aneuploidia van
- Locus specifikus próba -> kromoszóma régió meglétének vagy hiányának azonosítására -> látszik ha kontroll régióhoz kevesebb vagy több van
- Subtelomerikus próba -> apróbb terminális deléciók észlelésére
- Teljes kromoszóma festő próba -> látszik ha transzlokálódik
Multikolor FISH -> 5 eltérő fluorochromot használnak (cy5, DAPI, Texas red, FITC és Spectrum orange) -> minden chromoszóma egyedi szín kombinációban -> hypotesis nem feltétlen kell
FISH menete
A) Karyotipizálás emésztésig
1. Citrátos/Heparinos csőbe vér levétele
2. Tenyésztés
Attól függően hogy leukaemiás/ crista bxből vagy perifériából származik a minta inkubáljuk
a. 25cm3-es flaskába tesszük a nem-kitapadó fehérvéjestek proliferációja 72h alatt mitogén (phitoagglutinin) hatására (periféria)
b. leukaemiás minta esetén 48h tenyésztés
3. Cholhicin hozzáadása -> metafázisban megállítja a sejteket
4. Hypotonizálás KCl-el-> sejtek megduzzadnak és ckromoszómák kiszabadulnak
5. Fixálás: Metil alkohol, ecetsav 3:1 arányú keverékékével
6. Szuszpenziót tárgylemezre csöppentjük
7. Tripszines emésztés
B) Tripszinezést követően
1. Karyotipizálás emésztés lépése után
2. DNS denaturálás -> 70°C-on DNS kettős szál szétválik
3. Hibridizációs próbák bekötnek -> overnight párás 36°C
4. Nem kötődött próbák lemosása
5. DAPI-val sejtmagokat festjük
aCGH
Az array-CGH, akárcsak a kariotipizálás, az egész genomra vonatkozóan ad információt, azonban felbontóképessége lényegesen nagyobb. A vizsgálat a beteg DNS-mintájából és egy egészséges kontroll DNS-mintából történik.
Menete:
1. Több százezer rövid, 50−80 nukleotidból álló egyszálú DNS-molekulát, oligonukleotidot rögzítenek egy tárgylemez méretű lapkára (array-CGH kit). A beteg DNS-mintáját (vörös-Cy5) és a referencia DNS-t (zöld-Cy3) különböző színű fluorochrommal jelölik, denaturálják, majd a szilárd felületen található oligonukleotid próbákhoz hibridizálják.
2. Ezt követően egymás után, különböző színű lézerrel gerjesztve szkennerrel beolvassák a képet, majd az adatokat bioinformatikai programok segítségével értelmezik.
a. CytoSure szoftware terjedt el a legjobban, mely logaritmikusan adja meg a teszt és “referencia” minta arányából
b. Sárga – a zöld és piros szín egyenlő arányban van jelen, nincs sem deléció sem duplikáció a teszt mintán
c. Piros – A pirossal jelölt DNS mintából több van – Ha ez a teszt minta akkor duplikációt jelez
d. Zöld – A zölddel jelölt DNS mintából több van – Ha ez a referencia minta akkor deléciót jelez
3. Értékelés: vizsgálat kópiaszám-semleges heterozigóta állapotvesztések (LOH), uniparentális diszómiák (UPD) feltárására alkalmas.
a. Szűrés (mikor nyilatkozhatunk egy talált eltérésről):
i. Nagyság (min 20-100 kB, inkább utóbbi, de próba sűrűségtől függ) (szoftver)
ii. Próbák száma (min 5) (szoftver)
iii. Derivative log ratio (max 0,2-0,3) (szoftver)
b. Értékelés (hogy értelmezzük mit találtunk):
i. Fontos régiók, gének (szoftver)
ii. Régióban leírt CNV-k megítélése
iii. pathogén (Decipher adatbázis)
iv. benignus (DGV adatbázis)
v. dózis szenzitív gének (Decipher adatbázis)
vi. Elérhető publikációk átnézése (PubMed, OMIM)
!!!! Limitáció: nem fény mikroszkóp alapú, így csak CNV eltérést érzékel, vagyis vak a strukturális eltérésekre
Major anomáliák
Major anomália - életet élettartam és/vagy életminőséget súlyosan befolyásoló rendellenesség
van letalis - súlyos (kezeléssel is jelentősen csökkent QoL) -enyhe(kezeléssel jól QoL) kedvezőtlen kimenetel a funkció és/vagy az egyén szociális integrációja vonatkozásában (újszülöttek <5%-a)
* Cardiovaszkularis: Fallot tetralogia, ASD, VSD, PDA -> önmagukban is vagy szindróma részeként
* CNS: anencephalia, hydrocephalus, microcephalia, spina bifida
* GI: cheilo - palatoschisis, oesophagus atresia, diaphragma hernia, anus imperforatus
* Vese: agenesis, patkóvese, polycystás vese
végtagok részleges vag teljes hiánya
Minor anomália
Sem orvosi sem kozmetikai szempontból nem okoznak problémát, újszülöttek 10%-ában van jelen. Szokatlan anatómiai kép ami a beteg számára nem jár orvosi vagy kozmetikai következménnyel. Pl legenyhébb formái az antropometriaia variáns variánsok
* periauricularis lyuk
* epicantus
* szám feletti mellbimbó
* ductus lacrimalis stenosis
* syndactilia
* umbilikális hernia
* sacral pit
* epicantus
* 4 ujjas redő
Egy megléte nem vet fel genetikai eltérést, de minél több annál nagyobb a genetikai eltérés valószínűsége.
Izolált anomáliák
Primer:
* Malformáció: A fejlődést szabályozó gén(ek) mutációt szenvedhet(nek), így keletkezik a a test egy részének (pld.: végtag) primer morfológiai defektusa
* Diszplázia, amely a sejtek szövetekbe szerveződésének károsodása során jön létre.
Szerzett:
* Diszrupció: Az eredetileg normálisan fejlődő szerv az embriógenezis későbbi szakaszában különböző külső tényezők károsíthatják, ide tartoznak a gyógyszerek (pld.: thalidomid, retinsav), kémiai anyagok, sugárzás, sérülés, infekció (pld.: varicella), vaszkuláris vagy metabolikus tényezők által kiváltott diszrupciós rendellenességek.
○ Holt-Oram szindróma, vagy teratogén Thaloidomide embyropathia is okozhatja
* Deformitás: Szerzett, mechanikai ártalom következtében létrejövő deformitásokat (pld.: intrauterin kényszertartás, oligohydramnion, beidegzési- motilitási zavarok)
NIPT
Anyai vérből csak cell-free DNS kerül izolálásra. Ebben van anyai és embryonalis cell-free DNS ->Fontos hogy a foetalisfrakció legalább 4% legyen, ha az alatt van nem pontos a mérés. 7Mb feletti eltéréseket észlel, a cell-free DNS fragmentumokhoz indexet adnak, mert egyszerre több mintát futtatnak. Ezután a primerek bekötnek és transzkripció után gélelektrophoresis.
- Specifitás csak 13 Down, 13 Patau és 18 Edwards szindrómára valamint sex chromoszóma eltérésekre magas a többire csak tájékozódó jellegű
- Magzati frakció, 12. hét előtt nem elég magas-> fals negatív / értékelhetetlen vizsgálat
- Fals pozitivtás okai:
○ Lepényre korlátozódó mozaicizmus
○ Wanishing twin
○ Anyai mozaicizus (életkorral nő a jelenléte)-> szintén ok h miért nem diagnosztikus, ezért kell 37+ kombi teszt is
○ Anyai daganat jelenléte
○ Anyai CNV (de novo v öröklött)
○ Transzplant: Csontvelő vagy szerv férfi donortól
○ Nem rég történt vér transzfúzió
○ Technikai hiba (gyakoriság: 1-2/1000) - Fals negativitás okai:
○ Lepényre korlátozódó mozaicizmus
○ Alacsony magzati frakció
○ Anyai CNV
○Technikai hiba
PGD
Ha egy családban tudvalevőleg genetikai betegség kockázata áll fent (és ismert a genetikai hiba) lehetőség van preimplantációs genetikai diagnosztikára, abban az esetben, ha el szeretnék kerülni a betegséget, de nem szeretnénk (pl. vallási okokból) elvetetni egy magzatot.
PGD menete:
In vitro megtermékenyítést követően a fertilizáció utáni harmadik napon az ekkor 6-8 sejtes embrióból eltávolítanak egyetlen sejtet, mely genetikai állományát az adott genetikai hibától függően PCR vagy FISH technikával megvizsgálják és ha nem igazolják a kockázati tényezőként fennálló genetikai hibát, akkor beültetik az embriót az anyaméhbe és fejlődésnek indulhat a vizsgált betegséget biztosan nem hordozó gyermek.
PGD típusai:
* PGD-A - aneuploidia
* PGD-SR - Chromoszóma abnormalitás
* PGD-M - monogénes -> monogénes betegségre és HLA kompatibilitást is lehet nézni
Kisózásos DNS izolálás
- Lysis puffert adunk a vérhez
a. Fuga, SN leönt és újra lysis puffert mérünk és felszuszpendáljuk
b. ismétlés míg a minta nem veszti el vöröses színét- Emésztés 4-16 óráig
- 6Molos NaCl-t teszünk a csőbe és fuga
- Pellethez 96% ETOH-t adunk -> DNS kicsapódik a tetején -> eppendorfba mérjük majd 70%ETOH -> fuga, leszív -> szárítás
- TE puffert adunk a pellethez
- Homogenizálás ->forgatás és vortex
Tárolás
