Wat is het nut van een genetisch gemodificeerd proefdier en kan het ook anders?
- Je kan gericht onderzoek doen naar een specifiek gen
2. Knock-in & Knock-out muizen / mbv kruizingen
Wat is het voordeel van genetisch gemodificeerde proefdieren tov cel- en weefselkweken?
- Interacties tussen cellen zijn waarneembaar
- Niet alle cellen zijn kweekbaar
- Cellen veranderen in kweek
- Context waarin het weefsel zich bevindt is moeilijk na te bootsen
Wat is een transgeen en hoe maak je deze?
- Een dier waarin het doelwit gen vervangen wordt door het gen van interesse.
- Manieren
- Micro-injectie van DNA in pro-nucleus van 1-cellige zygote (bijv recombinant DNA / CRISPR-Cas9)
- Transfectie van DNA in de nucleus van een ES uit blastocyst
- Virale infectie van vroeg stadia embryo’s (max 8 celligen)
Wat is een ES?
Embryonale stamcel
Wat is een transgen en hoe krijg je specifieke expressie van een transgen in één specifiek orgaan?
- Het gen dat je inbrengt in het dier
2. Specifieke promotor voor het transgen plaatsen wat alleen in de nieren transcriptie aanzet
Wat is transgenese en wat zijn de beperkingen hiervan?
- Het inbrengen van DNA van een andere diersoort
- Beperkingen
- Gendisruptie = vaak lethaal
- Variabele intergratie site / variabele expressie
- Onbekend hoe vaak het gen in het DNA terecht komt
- Con-catameren –> gen gaat eerst aan elkaar plakken, daarna intergreren = hele hoge expressie
- Kost veel proefdieren voor relatief laag slaginspercentage
- Langdurige aanvraag procedure
Wat is een voordeel van Transgenese?
Veel transgenen zijn al gemaakt en daar kan je als onderzoeker gebruik van maken
Wat is een knock-out dier?
Een dier waar je een gen uit hebt geschakeld
Hoe maak je een knock-out dier?
- Kweken van ESC (uit een blastocyst / deze cellen kunnen gekweekt worden)
- Targetting factor maken
- Plaats targeting factor in de ES cellen
- Dubbele selectie op de ESC
- Proliferatie
- Injecteren in nieuwe blastocyst
- Blastocyst inbrengen bij schijnzwangere draagmoeder
- Geboren pups controleren op gen dmv PCR
Wat is de eis aan de ES cellen en waarom?
Gebruik een ES met een dominant kleurgen en plaats deze in een blastocyst van een dier met een recessief kleur gen. Zo kan je na het kruisen van de pups met een recessief gen dier kijken of het gen in de kiembaan aanwezig is
Wat is de opbouw van een targetting factor?
- Flankerende homologe armen die kunnen binden op de locatie waar je target gen zit
- Tussen de homologe armen zit een neomycine resistentie gen
- Achter de rechter homologe arm zit een hsv tyrosinekinase (= voor de negatieve selectie)
Wat is de dubbele selectie welke aanwezig is in de targetting factor?
1e = neomycine resistentie test = cellen plaatsen in neomycine vloeistof. Cellen die overleven zijn goed gegaan. 2e = negatieve selectie = ganciclovir toevoegen = de tyrosine kinase zet deze stof om in een giftige compound = cellen gaan dood
Waarom zit de HSV tyrosinekinase achter de tweede homologe arm?
Omdat dit aantoont of het gen construct via homologe recombinatie in het gen gekomen is of via spontane intergratie. De spontane intergratie cellen wil je niet!
Wat is een conditionele knock-out?
Een knock-out die alleen plaats vindt bij bepaalde voorwaarden. Zoals bijvoorbeeld alleen in de lever.
Waarom een conditionele knock-out?
- Een conventionele knock-out kan lethaal zijn
- Je wilt alleen een knock-out in een weefsel van interesse
- Je wilt alleen een knock-out op het tijdstip van interesse
- Bijvoorbeeld tijdens de ontwikkeling
- Op een bepaalde dag ivm meten effect medicatie - Je wilt alleen een knock-out op de locatie van interesse
Hoe maak je een conditionele knockout?
- LoxP sites in dier krijgen met homologe recombinatie
- LoxP construct maken
- Transgene muis met tissue specific promotor met het CRE gen erachter fokken
- LoxP dier en CRE dier kruisen
- Genen bij elkaar zorgt voor een knock out dier
Wat is CRE?
Een bacterieel systeem wat in eukaryote cellen wordt gebruikt om een exon weg te knippen.
Wanneer CRE LoxP sites tegen komt plakt hij deze aan elkaar. Genen tussen LoxP sites worden dus verwijderd.
Wat is de opbouw van het LoxP construct?
Homologe arm - LoxP - target gen - LoxP - Neomycine resistentie gen - LoxP site - homologe arm - HSV tyrosinekinase
Waarom fokken we een muis met een promotor en een CRE gen?
Zodat deze op het moment van bevruchting de knock-out plaats vindt en je zo met doorkruizen een homozygote knockout kan maken
Wat is een induceerbare knock-out?
Dan plaats je geen tissue specific promotor voor de CRE maar bijvoorbeeld een TetO promotor (dan wordt CRE afgeschreven wanneer het dier Doxycycline toegediend krijgt). Deze muis wel eerst nog kruisen met LoxP muis
Wat is het nadeel van een TetO muis voor CRE afschrijven?
TetO kan doorlekken naar ongewenste weefsels
Wat is CreERT2?
Een mutant extrogen receptor die fuseert met CRE
Hoe werkt de CreERT2?
CreERT2 wordt geactiveerd na het inspuiten van tamoxifen. CreERT2 gaat naar de nucleus en de knockout vindt plaats.
Wat is Floxin?
Dit is de naam voor een 1 nucleotide knockout.
