Gentechnik III Flashcards
Was bedeutet omics?
-beschäftigt sich mit der Gesamtheit ähnlicher Einzelelemente
Was wird durch ein microarray untersucht?
-die Genexpression einer Zelle oder Gewebe
Wie wird ein Microarray gemacht?
- Sonden für bestimmte Gene werden auf eine feste Unterlage an verschiedene Spots gegeben
- RNA Gemisch aus Organismus wird revers transkribiert zu cDNA und diese wird fluoreszenzmarkiert
- cDNAs hybridisieren auf Unterlage an komplementäre Sonden
- Intensität des Signals gibt die Abundanz der einzelnen RNAs in dem Gemisch an
- beim Vergleich zweier Proben werden die cDNAs beider Proben mit untersch. Fluoreszenzfarbstoffen markiert->unterschiedliche Farben auf Spots zeigen an welche RNAs in den jeweiligen Proben vorhanden sind und welche in beiden(Mischung der Farben)
- > zum Vergleich Genexpression unter versch. Konditionen
HDS Schritte Hochdurchsatzsequenzierung?
- Isolierung genomischer DNA
- DNA wird geschert und amplifiziert
- Hochdurchsatzsequenziergerät sequenziert einzelen Fragmente
- Programm ordnet sequenzierte Fragmente und somit erhält man Genomsequenz
HDS Wie funktioniert die Brücken PCR?
Brücken PCR:
- 2 unterschiedliche Adapter(Oligos) werden an die DNA-Fragmente angebracht-> deren Sequenz ist komplementär zu später verwendeten Primern
- Fragmente werden nun über Adapter an eine Platte gebunden, auf der sich ein dichter Rasen von ebenfalls gebundenen Primern befindet
- Fragmente beugen nun mit freien Adapter zu Primer hin->Pol synthetisiert neuen Strang->Trennung durch Denaturierung
- dieser Vorgang mehrmals wiederholt bis auf der Platte viele Cluster mit jeweils identischen Sequenzen entstehen
Wie funktioniert die Illumina-Sequenzierung nach Brücken PCR?
-Primer und Pol dazugeben
-fluoreszent markierte Nukleotide mit jeweils unterschiedlich Farben + reversible Terminatoren
(chemische Gruppe an 3´Position, die zunächst Verlängerung nicht erlaubt, aber später chemisch abgspalten werden kann und 3´OH freisetzt)
1. Zylus :
-komplementäres Nukleotid wird angehängt und es kommt zum Kettenabbruch->auswaschen-> Foto wird gemacht->abhängig von der Farbe kann Base bestimmt werden
-Terminationsgruppe + Floureszenzfarbstoff werden abgespalten
->nächster Zyklus
-dies passiert an allen Clustern gleichzeitig
Was kann mit Next Generation Sequencing gemacht werden
- ganze Genome können sequenziert werden
- Transkriptome
- Metagenomics->Sequenzierung von Proben mit mehreren Organismen
- Mikrobiome
Was ist Proteomics?
-man möchte bei einem Gemisch von Proteinen alle Proteine gleichzeitig identifizieren
Wie Funktioniert LC/MS
- Protein wird mit Protease(meistens Trypsin) in Peptide zerschnitten
- Peptide werden auf Säule gegeben
- > Flüssigchromatografie
- durch verschiedene chemische Eigenschaften eluieren Peptide zu unterschiedlichen Zeiten aus Säule heraus
- > Identifikation der Peptide durch Massenspektrometrie-> Masse
- Masse abhängig von Identität der Aminosäuren des Peptids
- Massen der Peptide werden mit Datenbank verglichen
- > Rückschluss auf Protein
- auch für Proben mit vielen Proteinen möglich
Wie kann von einzelne Peptiden aus der LC/MS die Aminosäuresequenz bestimmen?(*)
- MS-Fragmentierung
- Peptid wird hochionisch beschossen->Aminosäuren fallen ab-> Masse Aminosäuren kann bestimmt werden
Welche 3 Bereiche sind nötig für LC/MS?
- Massenspektrometrie
- Proteinchemie
- Bioinformatik
Problem Proteomics?
-nicht quantitativ
SILAC
- stable isotope labeling by amino acids in cell culture
- quantitativer Vergleich von Proteinen bzw. Proteingemischen
- 2 Konditionen werden miteinander verglichen
- einmal mit normalen Isotopen und einmal Zellen verfüttert mit schweren Isotopen(z.B. 13^C-markiertes Arginin)
- Proteine werden mit 13C also markiert(chemische Eigenschaft gleich-> läuft in LC gleich
- LC/MS zeigt Doppelpeaks-> leichtes und schweres Isotop
- quantitativer Vergleich, weil beide haben gleiches chemisches Verfahren,Verdau,LC
- > Peak-Größen Vergleich Abundanz Peptid
- > Quantifizierung
Was ist funktionelle Genomik?
-untersuchen funktionelle Information über die Gesamtheit der Gene eines Organismus
Wie funktioniert eine Enhancer Trap?
- man möchte durch Enhancer vermittelte Expressionsmuster verstehen->dafür Drosophila
- dafür benötigt man ein P-Element
- > transposon(springendes Element) mit lacZ-Gen + rosy(färbt wenn aktiv Fliegenauge rot)
- Fliegenlinie, die P-Elemnt besitzt wird gekreuzt mit Fliegenlinie, die Transposase exprimiert->P-Elment kann springen
- P-Element kann nun in die Nähe eines Enhancers springen->Gen ist zerstört+ lacZ ist unter Kontrolle des enhancers des Gens
=>Ergebnis: Gen ist ausgeschaltet+ Expressionsmuster des Enhancers durch lacZ-Färbung erkennbar
