Gentechnik Flashcards
Definition rekombinante DNA und GVO?
rekombinante DNA: neues Molekül, das durch Kombination von zwei nicht homologen DNA-Molekülen entstanden ist
Gentechnisch veränderter Organismus: Organismus der DNA-Sequenzen eines anderen Organismus enthält und nicht durch Kreuzen hergestellt wurde
Definition/Eigenschaften Vektor?
-Vektor ist ein Vehikel mi dessen Hilfe DNA in Wirtszellen eingebracht und vermehrt werden kann
Eigenschaften:
- können fremde DNA aufnehmen
- können sich in Wirtszellen autonom vermehren
- Selektion von Wirtszellen mit Vektor oft durch Antibiotika-resistenzgen
Beispiele:
- Plasmide: zirkuläre selbstreplizierende DNA
- Phagen:Teile der Phagen DNA können durch Fremd-DNA ersetzt werden
- Hefen
Wirtszelle Definition
Vektoren werden in diese eingeschleust/aufgenommen und können sich dort autonom vermehren. Selektion von Wirtszellen mit Vektor oft durch Antiobiotikaresistenzgen (z.b. Amplicin Resistenzgen). Wirtszellen in der Gentechnik oft in form von Bakterien
Was sind die Eigenschaften der Schnittstellen von Restriktionsenzymen?
- schneiden die DNA an einer definierten Sequenz
- schneiden oft an palindromischen Sequenzen
- entweder blunt oder mit 3´ und 5´-Überhang
- > sticky ends
Wie sieht ein Plasmid aus, dass für Klonierung benutzt wird?
- ori
- Antibiotika-Resistenzgen
- multiple cloning site: viele verschiedene Schnittstellen für Restriktionsenzyme
- lacZ Indikator-Gen->Insertionsort befindet sich innerhalb des Gens->Blau-weiß-Screening
Wie wird ein DNA-Fragment in einen Vektor kloniert?
- Vektor(Plasmid) und Fragment werden mit dem gleichen Restriktionsenzym(z.B. EcoR1) geschnitten
- komplementäre Enden lagern übereinander
- > Fragment wird in den Vektor hineinkloniert
- Behandlung mit Ligase
- Gemisch wird in Wirt transformiert(z.B. E.COli)
Wie kann man eine erfolgreiche Klonierung nachweisen?
- Selektion auf Nährboden mit Ampicillin und XGal
- wenn Wirtszelle Plasmid nicht aufgenommen hat
- > kein Ampicillin Resistenz-gen-> sirbt
- wenn Wirt Plasmid ohne DNA Fragmentaufgenommen hat-> LacZ wird exprimiert-> β-Galactosidase->XGal färbt blau
- nur bei erfolgreicher Klonierung lebendige ungefärbte Kolonie
Was ist gerichtete und was ist ungerichtete Klonierung?
- gerichtete Klonierung: Vektor und Insert werden mit zwei untersch. Restriktionsenzymen behandelt
- ungerichtete Klonierung: vektor und Insert werden mit einem Restriktionsenzym behandelt -> beide Enden des Inserts sind zu beiden Enden des Vektors kompatibel
Was ist eine Genbank?
-Sammlung von DNA-Fragmenten, die das gesamte Genom(oder Transkriptom) eines Organismus repräsentieren in einem geeigentem Vektor
Wie wird eine Genbank hergestellt?
- DNA eines Organismus wird isoliert
- DNA wird fragmeniert mit Restriktionsenzymen
- DNA-Fragmente werden in Plasmide inseriert
- Plasmide werden in Bakterien transformiert
- > Sammlung von Bakterien, die alle unterschiedliche DNA-Fragmente enthalten
- > DNA in bearbeitbarer Form
Wie werden bestimmte Seqenzen in einer Genbank gefunden?
-durch Screeining mit einer bestimmten Sonde
Wie wird DNA isoliert?
- DNA+Puffer+Detergenzien und zerkleinern->DNA in wässriger Lösung
- Proteine werden aus Zell-lysat entfernt(z.B. Phenol/Chloroform Extraktion)
- Alkoholfällung und Rehydrierung
- Außerdem EDTA um DNAsen zu inhibieren
Wie funktioniert die Gel-elektrophorese
- mit Agarosegel
- elektrischer Strom wird angelegt
- DNA wandert durch Gel
- wird aufgrund der Gelmatrix aufgehalten
- kleinere Fragmente wandern weiter als größere Fragmente
- man vergleicht die Migration eines zu untersuchenden DNA-Fragments mit der eines Markers
- außerdem muss DNA mit fluoreszenten Farbstoff gefärbt werden->leuchten unter UV-Licht
Wie funktioniert eine PCR?
- man benötigt: zu amplifizierende dsDNA,2 Oligonukleotide, die zu jeweils einem Strang komplementär sind, TaQDNA Pol, dNTPs
- > erhitzen führt zu aufschmilzen der dsDNA -> Primer hybridisieren an DNA
- DNA Pol synthetisiert komplementären Strang
- > neuer Zyklus
