Gentechnik 2 Flashcards
Warum und Wie wird DNA markiert?
-für Hybridisierungsexperimente
-durch Einbau markierter Basenanaloga in die DNA:
-z.B. radioaktive Isotope, Markierung über floureszierenden Farbstoff oder Nukleotide,
die modifiziert sind und über Antikörper nachgewiesen werden
-Einbau über random priming und nick translation
Was ist cDNA?cDNA-Genbank vs Genombank
-complementary DNA
-gespleißte mRNAs werden revers transkribiert
-cDNA-Genbank beinhaltet das Transkriptom
-
Was ist das Ziel beim Southern blotting?
Wie funktioniert Southernblotting?
1.-Es wird eine Gelelektrophorese mit DNA
-Gemisch gemacht->DNA nach Größe aufgetrennt
-DNA muss auf feste Unterlage transferiert werden
Southern Transfer: Nitrocellulose-Filter wird auf Gel gelegt und darüber Stapel aus Tüchern
-Gel befindet sich in Pufferlösung->durch Kapillarkraft der Tücher wird Flüssigkeit durch Gel und Tücher gezogen
-DNA bleibt auf NitrocelluloseFilter kleben->DNA von Gel auf Filter transferiert
2.Filter wird mit Sonde und Hybridisierungsflüssigkeit in eine Plastiktüte gegben und vermischt -> Sonde heftet an komplementäre Sequenz
Filter wird gewaschen->Sichtbarmachung mit Autoradiogramm
Was ist der Zweck des Northern Blotting?
- Detektierung von RNA
- gleiches Prinzip wie beim Southern-Blotting
Was ist der Zweck des Western Blotting?
-Nachweis von Proteinen mithilfe von Antikörpern
Vorgehen Western-Blotting(5-Schritte)
- Proteine aufgetrennt in SDS-Page-Gel
- Transfer auf Mebran
- Inkubation mit primären Antikörper
- Inkubation mit sekundären Antikörper
- Detektion(z.B. Chemilumiszenz)
Wie funktioniert der Transfer beim Western Blotting?
- Proteine in Gel
- Spannung ist angelegt, sodass Proteine aus dem Gel auf die Membran migrieren->Abbild des Gels auf Membran
Wie funktioniert die Detektion beim Western Blotting?
- mithilfe von 2 Antikörpern
- primärer Antikörper, der gesuchtes Protein bindet
- sekundärer Antikörper: erkennt primären Antikörper und ist gekoppelt mit Enzym, dass Substrat umsetzt
- > Signal(Farbe,Chemiluminiszenz)
Wie werden die Antikörper beim Western Blotting gewonnen?
- primärer Antikörper: Antigen(protein) wird in Säuger(z.B. Kaninschen) injiziert-> Immunsystem produziert Antikörper
- im Serum des Tiers gibt es Antikörper
- Sekundäre Antikörper mit Enzym käuflich zu erwerben->universell gegen Stamm versch. Antikörper(z.B. Kaninchen)
Wie kann man Antikörper gewinnen ohne Säuger?
Wie funktioniert das?
-Epitope tagging-> Einfügen best. Aminosäuresequenz in Zielprotein->Antikörper gegen dieses
-Gen wird rekombinant Fusioniert mit Epitope DNA-> in frame Fusion-> Einbringung in Zielzelle
Gen exprimiert zu Protein+ Tag und kann von Anti-Eptitope-tag detektiert werden
-z.B. in Western Blot
Wie funktioniert eine klassische Sanger-Sequenzierung?
-Kettenabbruchmethode
-ssDNAs(die DNA, die man sequenzieren möchte)
+ oligos, die vor der Sequenz, die man lesen möchte primen+ DNA pols
-dNTPs(radioaktiv markiert) und jeweils eine Art ddNTPs(z.B. ddATP)
-es kann jedes mal wenn ein dAMP eingebaut werden, auch ein ddAMP eingebaut werden, was zum Abbruch
-man erhält viele DNA-Moleküle mit unterschiedlichen Längen, die immer durch Einbau eines ddATPs nicht weiter elongiert wurden
-dies macht man 4 mal-> für alle Nukleotide
-DNAs werden auf Gel aufgetrennt->verschiedene Längen entsprechen verschiednenen Basen
moderne Sanger Sequenzierung
- jedes ddNTP mit eigener Fluoreszenzfarbmarkierung
- markieren jeweils an welcher Base Kettenabbruch stattgefunden hat
- alle vier ddNTPs zusammengemischt und eine Reaktion wird auf Kapillargel aufgetragen
- Laser detektier fluoreszenten Farbstoff
- Ergebnis wird auf Chromatogramm aufgetragen
