Gentechnik 4 Genome editing Flashcards
Auf welche weise kann ein Doppelstrangbruch repariert werden?Was sind weitere Möglichkeiten gezielte Doppelstrangbrüche zu nutzen?
- non homologous end joining(fehlerhaft-> kann zu Deletionen/Insertionen führen)
- wenn Donor-DNA angeboten wird->homologe Rekombination->Donor-Sequenz wird in Ort des Schnitts inseriert
- DNA Stück durch zwei Schnitte herausschneiden und durch nhe zusammenführen
- gezielte Translokation von DNA
Was ist eine Zinfinger-Nuklease? Wie funktioniert sie?
- Enzym Fok1->Restriktions-Endonuklease + verschiedene Zinkfinger(DNA-Bindende Module)
- > Zinkfinger geben Spezifität der DNA-Bindestelle vor
- > mehrere tandem Zinkfinger, die jeweils 3 spezifische Basen erkennen
- Fok1 arbeitet als Dimer-> 1 Fok1 auf jeder Seite, um DNA vollständig zu schneiden
Nachteile Zinkfinger?Nachteile TALEN?
Vorteil Cas9?
- Zink-finger müssen für Bindung an spezifische DNA-Sequenz designt werden->sehr aufwendig
- kommt zu off-target Effekten
TALEN
-repetetive Sequenzen machen es schwierig TALENs zu klonieren
Was ist TALEN?
- transcription activator-like effector nuclease
- Fusions-Protein aus TAL-Effektor DNA-bindende Domäne und Endonuklease I
- modulare Struktur: ein Talen-Protein=34-AS-modul, dass ein einziges Nukleotid erkennt
- Nukleotidspezifität bestimmt durch AS 12 und 13 des Moduls
- tandem DNA-TALEN-Bindemodule
- fusioniert mit Endonuklease Fok1
- Fok1 arbeitet als Dimer-> FusionsProtein auf jeder Seite, um DNA vollständig zu schneiden
Was ist CRISPR?
- clustered regularly interspaced palindromic repeats
- Abschnitte im Genom, die Teil des CRISPR-Systems sind
CRISPR Grundzüge erklären?
- Mechanismus um fremde DNA(v.a. Phagen) unschädlich zu machen
- funktioniert als Art adaptives Immunsystem
- fremde DNA erkannt-> in CRISPR locus eingebaut
- aus CRISPR-Locus-> crRNAs transkribiert
- mithilfe crRNAs können Nukleasen(Cas9) spezifisch Abschnitte fremder DNA erkennen und zerschneiden
Wie sieht der CRISPR-Locus aus?
- repeats(mit gleicher Länge und Sequenz) mit spacern dazwischen, die fremde DNA enthalten
- die Spacer werden als Protospacer aus Fremd-DNA herausgschnitten
- davor liegt die leader region:
- Promotor für Transkription der crRNA
- upstream vom leader: CAS-Gene(CRISPR associated), die das CAS Operon bilden(CAS9 und andere CAS Gene)
Wie wird bei Crispr RNA benutzt?
- gesamter Abschnitt aus repeats und spacern wird als pre-crRNA transkribiert und zu crRNAs prozessiert
- zusätzlich werden tracrRNAs transkribiert, die komplementär zur repeat-sequenz der crRNA ist
- cas9 asoziiert mit tracrRNA und crRNA und kann entsprechende Zielsequenz schneiden
Wie funktioniert Cas9?
- benötigt crRNA->gibt Schnittstelle für Cas9 vor
- tracrRNA
- Cas9 hat zwei Nukleasen RuvC und HNH, die jeweils einen Strang schneiden(wenn beide schneiden->DS-Bruch)
- Erkennungssequenz für Schnittstelle auf Ziel-DNA
- > PAM(Protospacer adjacent motif)
CRISPR-CAS-System?
- benötigt CAS9 und sgRNA(single guide RNA= tracrRNA und crRNA Fusionsmolekül)
- sgRNA diktiert welche DNA von CAS9 geschnitten werden soll
- man kann also immer das selbe Enzym benutzen und muss nur die Sequenz der sgRNA verändern
Erweiterungen CRISPR-CAS-System
- Mutation von CAS9, die eine Endonuklease deaktiviert, nur ein Strang wird geschnitten
- beide Endonukleasen+Fusion CAS9 und anderes Protein, die in bestimmter Region Effekt hat(z.B. Chromatinregulator
Was ist forward genetics und was ist reverse genetics?
- forward genetics:
- Biologischer Prozess->Phänotyp->Gen->Protein
- man untersucht Mutanten, die Defekt in zu untersuchenden Prozess haben(Phänotyp)->Rückschluss Effekt Protein auf einen Prozess
Reverse Genetics:
- Prozess->Protein->Gen->Phänotyp
- man möchte Funktion von Protein verstehen->Extrakt von Proteinen->Fraktionierung von Proteinen mit bestimmter biochem. Aktivität
- > was wenn Protein nicht vorhanden(Mutagenese)
Screening vs Selektion?
-mutagenisierte Bakterien entweder
Screen: auf Agar-platte wird die Kolonie mit dem gesuchten mutanten Phänotyp gesucht
Selektion: plattieren der Bakterien und nur die von Interesse überleben
z.B. Ampicillin-resisistente Mutanten werden gesucht->
man plattiert mutagene Bakterien auf Agarplatte mit Ampicillin-> nur resistente Kolonien überleben
Was ist eine Komplementationsanalyse?
- an bestimmten Prozess sind mehrere Gene beteiligt
- jedes Gen ergibt wenn mutiert gibt den gesuchten Phänotyp
- Sammlung vieler Mutanten mit Phänotyp
- > man nutzt Komplementation(funktionelle Ergänzung zweier mutierter Allele) und setzt Mutanten in Komplementationsgruppen
- so findet man heraus wie viele Gene an einem Prozess beteiligt sind
Reverse Genetik Beispiel und erklären
-Aufreinigung eines Proteins->Gen->Funktion des Proteins:
Knockout eines Gens
-Sequenz des Gens wird ersetzt mit DNA Stück, das einen Selektionsmarker besitzt durch homologe Rekombination inseriert
->Gen ist deaktiviert
- jetzt wird für Anwesenheit des Markers selektiert
