G.6 : Intro au Diagnostic Moléculaire

Question 1

Diagnostic moléculaire: définition

Answer 1

Diagnostic de pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes, ou de l’épigénome

Question 2

Pourquoi est-ce que les sites consensus d’épissage (à la limite entre exon et intron) sont des régions importantes en diagnostic, même s’ils ne font pas partie de régions codantes (exons)?

Answer 2

Des mutations dans ces sites peuvent affecter le patron d’épissage (donc: exon-skipping, incorporation de nouveaux exons, etc), ce qui affecte la structure de la protéine.

Question 3

Est-ce que toutes les variabilités du génome sont pathogéniques?

Answer 3

Non, ce ne sont pas toutes les variabilités qui causeront un phénotype pathogénique.

Les variabilités non-pathogéniques peuvent servir à comparer les profils génétiques de différents individus (ex: celui du donneur et du receveur lors d’une greffe)

Question 4

Est-ce que les variations de novo ont plus de chances d’être pathogéniques que ceux transmis par les parents?

Answer 4

Oui

Environ 70 variations surviennent de novo dans notre génome

Question 5

Nommer quelques causes des variations de novo

Answer 5

Causes internes:

• Dépurination
• Déamination
• Radicaux libres
• Erreurs de la polymérase
• Méthylation, etc

Causes externes:

• UV, Radiation, chimiques

Question 6

Vrai ou faux: les îlots CpG dans le génome sont des régions beaucoup plus à risques de mutation?

Answer 6

Vrai, en raison de la méthylation des cytosines qui sont enclins à se désaminer en U.

Les mutations (CG ⇒ TG) sont 20x plus fréquentes que les autres types de mutation

Question 7

Qu’est-ce qu’une région microsatellite (type de variation moyenne)?

Answer 7

Région du génome où une petite séquence (ex: CA) est répétée.

Le nb de répétitions peut varier d’un individu à l’autre.

Question 8

Quelles est le type de mutation le plus fréquent parmis les suivants: insertions, délétions, substitution?

Answer 8

Substitutions

Question 9

Nomme les 4 conséquences possibles d’une variation

Answer 9

1. Homologue ou silencieux (a.a. ne change pas) - bénin, sauf si le changement interfère avec l’épissage
2. Faux-sens (a.a. changé)
3. Non-sens (codon changé pour codon STOP)
4. Altération du cadre de lecture

** 3 et 4 sont les plus fréquemment pathogéniques

Question 10

Mutation Perte de fonction vs. Gain de fonction

Answer 10

Perte de fonction:

• Quantité de protéines produites diminue
• Réduction de l’activité de la protéine (ex: mutation dans le site actif d’un enzyme)

Gain de fonction:

• Augmentation de la quantité de protéines produites (ex: promoteur plus puissant)
• Augmentation de l’activité de la protéine
• Nouvelle fonction de la protéine

Question 11

Quelles sont les 2 catégories de maladies causées par des mutations dynamiques?

Answer 11

1. Maladies causées par grandes expansions (ex: Syndrome X fragile, Steinert)
   - Les expansions = dans parties non-codantes
2. Maladies causées par des petites expansions (ex: Huntington, SCA1,…)
   - Les expansions = typiquement dans parties codantes

Question 12

On veut isoler l’ADN des leucocytes d’un patient ayant reçu une greffe de moelle osseuse. Est-ce que cela pose problème?

Answer 12

Oui, car l’ADN des leukocytes (dans le sang du patient) pourrait être celle du doneur, et non celle du patient.

Question 13

Quelles sont 2 propriétés de l’ADN qui permettent son isolation?

Answer 13

• Charge négative
• Adhésion sur une membrane de verre ou silice

Question 14

Quelles sont 2 techniques pour déterminer l’efficacité d’une isolation d’ADN?

Answer 14

1. Densité optique: ratio 260/280nm (260nm = absorbtion max ADN)
2. Teintures intercalantes (composés qui se fixent à l’ADN)
   - Ex: bromure d’éthidium
   - intensité du signal = estimation quantité & taille d’ADN

Question 15

Quel est le principe de base de l’hybridation?

Answer 15

Utilisation d’une sonde (séquence de nucléotides complémentaires à une région du génome) avec un signal fluorescent, qui peut être détectée.

1. Mélanger sonde & ADN du patient
2. Isoler l’ADN
3. Si signal fluorescent est détecté sur l’ADN du patient: il y a eu hybridation entre la sonde & l’ADN (donc: la séquence complémentaire à la sonde est bel et bien présente dans le génome du patient)

Question 16

Vrai ou faux: on peut utiliser les méthodes d’hybridation pour déterminer si un patient est homozygote et hétérozygote pour un certain allèle

Answer 16

Vrai!

Il suffit d’utiliser 2 sondes (1 pour l’allèle sauvage, 1 pour l’allèle muté) marquées avec des couleurs différentes

Si on détecte les 2 couleurs: l’individu = hétérozygote

Question 17

Sur un électrophorèse capillaire, le courant électrique permet de séparer les fragments d’ADN selon leur:

Answer 17

Taille

Les fragments plus petits vont migrer plus rapidement. Leur taille d’un fragment peut donc être inférée selon sa distance de migration sur le gel.

Question 18

5 étapes du Buvardage Southern (Southern Blot)

Answer 18

1. Digestion de l’ADN génomique (ex: enzymes de restriction)
2. Électrophorèse capillaire
3. Transfert des fragments d’ADN sur une membrane
4. Hybridation (avec sondes)
5. Détection (des sondes) par audioradiographie

Question 19

Pour faire un PCR, on a besoin de:

Answer 19

• Échantillon d’ADN
• Polymérase (Taq polymérase)
• Nucléotides
• Amorces
• Machine PCR
• Ions tampons

Question 20

Quelle est la formule pour calculer le nb de molécules d’ADN présentes après un certain nb de cycles PCR (si on commence avec une seule molécule d’ADN)

Answer 20

2ⁿ

où n = nb de cycles PCR

Question 21

Que permet la technique PCR-migration? (qui combine la technique PCR et le buvardage Southern)

Answer 21

Dans cette technique, on utilise la PCR pour amplifier un certain gène (pour le rendre plus visible). L’électrophorèse permet ensuite d’évaluer la taille du gène amplifié par PCR.

Cela permet de détecter:

• Mutations d’insertions ou délétions (qui font varier la taille d’un gène et donc sa distance de migration sur le gel)
• Contamination foeto-maternelle

Question 22

Comment fonctionne la PCR-digestion?

Answer 22

1. PCR: amplifier un gène
2. Digestion du produit PCR par une enzyme de restriction (qui reconnait une séquence spécifique, qui se retrouve normalement sur le gène testé)

Si l’enzyme de restriction ne peut pas digérer le produit PCR: son site de restriction ne se trouve plus sur le gène (donc: mutation est survenue).
Ainsi, la taille attendue ne sera pas respectée sur la migration sur gel.

Question 23

Nomme une application de la PCR-digestion

Answer 23

• Détecter des mutations quelconques (en détectant un site de restriction créé ou aboli par une mutation ponctuelle)

Question 24

Dans la technique ASPE (Allele Specific Primer Extension), pourquoi est-ce qu’on utilise différents amorces (qui ont des séquences différentes en position 3’ et qui émettent un signal différent)?

Answer 24

Ces amorces servent à détecter des SNPs dans la région où ils devraient hybrider à l’ADN.

Ex: on utilise 2 amorces. Le premier amorce a une séquence 3’ complémentaire à l’allèle sauvage, le 2e amorce est complémentaire à l’allèle muté (a une différente séq en 3’).

Si après PCR, on détecte seulement le 1er amorce dans le produit PCR, il y avait seulement de l’allèle sauvage dans l’ADN du patient. Si on détecte les 2 amorces, le patient a les 2 allèles (hétérozygote).

Question 25

Quel est l'utilité des ddNTPs dans la méthode Sanger? (chacun des 4 ddNTPs est marqué par une couleur spécifique)

Answer 25

Lorsqu'un ddNTPs est incorporée dans une chaîne d'ADN en cours de formation (par PCR), cela empêche la polymérisation de continuer. Donc, la chaîne d'ADN en formation se termine avec l'incorporation d'un ddNTP.

Question 26

Vrai ou faux: la méthode Sanger utilise les techniques de PCR et d'électrophorèse.

Answer 26

Vrai! Après un PCR standard pour amplifier notre échantillon d'ADN, on expose ensuite la polymérase à des nucléotides normaux mais aussi des ddNTP. L'électrophorèse est ensuite utilisée pour séparer les fragments d'ADN de différente taille obtenus.

Question 27

Quel genre d'information est-ce que la méthode Sanger permet d'obenir?

Answer 27

La séquence de nucléotide d'un fragment d'ADN. Donc, il s'agit d'une bonne méthode pour étudier des gènes avec plusieurs mutations dispersées à travers le gène (substitutions ou des petites délétions/insertions)

Question 28

Quel genre d'information peut-on obtenir avec un PCR temps-réel?

Answer 28

On peut détecter le produit alors que la réaction de polymérisation (l'amplification) est en cours, grâce à l'utilisation d'une sonde avec fluorescence. \* La sonde se lie à l'ADN simple brin, de même que l'amorce

Question 29

Comment est-ce que la sonde TaqMan permet de visualiser la quantité d'ADN produite en temps réel, lors de la réaction PCR?

Answer 29

La sonde comporte un **domaine quencher**, et un **domaine de fluorescence**. Normalement, le quencher inhibe le signal fluorescent. Cependant, lorsque la **sonde est incorporée** dans une chaîne d'ADN (par hybridation), le **quencher est clivé** et un **signal de fluorescence est généré.** On peut **quantifier l'intensité de ce signal**, ce qui permet de détecter en temps réel l'amplification d'ADN par PCR.

Question 30

Nomme 2 applications de la PCR temps-réel

Answer 30

1. **Discrimination allélique** (2 types de sondes utilisés, pour détecter l'amplification de 2 allèles différents) Ex: on peut déterminer si un individu est homozygote normal, hétérozygote, ou homozygote muté 2. **Quantification** (relative ou absolue) Ex: on a 2 échantillons d'ADN (de 2 individus) et on utilise une sonde pour une allèle spécifique. Si l'échantillon 1 atteint le seul de détection **1 cycle** avant l'échantillon 2, on peut conclure que l'échantillon 1 avait 2 copies de l'allèle, alors que l'échantillon 1 avait une copie. (Règle du 2ⁿ)

Question 31

Pourquoi est-ce que la technique Multiplex Ligation Probe Amplification utilise une sonde composée de 2 sous-unités (au lieu d'une seule)?

Answer 31

Cela confère une plus grande spécificité d'hybridation au test

Question 32

Quel type de mutation est-ce que la technique MLPA permet de détecter?

Answer 32

## Footnote **Délétions** et **duplications** Ex: En utilisant des sondes qui s'hybrident à différents exons d'un même gène, on peut déterminer si 1 copie d'un des exon a été délété (si le signal pour cette sonde est plus faible).

Question 33

Décris brièvement les étapes de la MLPA

Answer 33

1. Dénaturation de l'ADN 2. Hybridation des 2 portions de la sonde (ils vont s'hybrider à un nucléotide de distance) 3. Ligation des 2 portions 4. Amplification PCR des sondes fusionnées 5. Électrophorèse capillaire 6. Analyser (comparer) l'intensité des signaux émis par les sondes \* Chaque sonde a une **région "stuffer"** de longueur différente, qui ne s'hybride pas: cette séquence sert à introduire une différence de taille entre les sondes, afin de pouvoir les séparer sur le gel.

Question 34

Quels avantages confèrent les techniques de **séquençage massivement parallèle** (nouvelle génération)?

Answer 34

* Compartimentalisation: plusieurs réactions de séquençage se produisent en même temps, ce qui permet d'analyser un nombre beaucoup plus grand de gènes simultanément * Permet d'analyser l'ADN de plusieurs patients en même temps (en utilisant un code-barre moléculaire spécifique pour chaque patient) * Diminution du coût

Question 35

Quelles sont quelques techniques (3) utilisées pour fragmenter l'ADN?

Answer 35

* Sonication * Digestion * Nébullisation

Question 36

Que permet le processus de **capture**?

Answer 36

## Footnote Isoler l'**exome** du reste du génome, pour ne séquencer que l'exome (qui représente 1% du génome).

Question 37

Décris brièvement les étapes de la PCR-émulsion

Answer 37

Matériel de départ: * fragments d'ADN (obtenus par fragmentation), * billes avec adaptateurs (séquences d'ADN) permettant à ces billes de lier les fragments d'ADN 1. Mélanger avec huile: création de micelles qui contiennent 1 bille & 1 fragment d'ADN 2. Le fragment d'ADN se lie à la bille, et subit une amplification 3. Déposer chaque bille dans un puits, et procéder au séquençage du fragment d'ADN amplifié (centaines ou milliers de billes analysés en même temps) Ainsi, les différents fragments d'ADN ont été séparés, amplifiés, et séquencés. Ceci permet de faire plusieurs tests en même temps

Question 38

Décris brièvement le processus de PCR-Cluster (phase solide)

Answer 38

Matériel de départ: * fragments d'ADN (obtenus par fragmentation), * plaques avec adaptateurs (séquences d'ADN) permettant à ces plaques de lier les fragments d'ADN 1. Les fragments d'ADN se lient à des adaptateurs sur la plaque 2. Ces fragments sont amplifiés par cycles PCR: cela forme des amas de fragments d'ADN identiques 3. Chaque amas sur la plaque = séquencé (en même temps)

Question 39

Comment se fait le séquençage en parallèle, à partir d'un "flow cell" qui contient plusieurs puits avec leur propre fragment d'ADN?

Answer 39

Par hybridation: * Ajout de nucléotides spéciaux avec **signal fluorescent** & un **domaine chain-termination**: un nt s'hybride avec la première base de chaque fragment d'ADN (dans son "puit") * Prendre une "photo" du patron de fluorescence * Lavage: enlever le domaine fluorescent & chain-termination. Cela permet de continuer le processus d'hybridation. * Recommencer le cycle (ajouter un 2e nucléotide et prendre une 2e photo)

Question 40

Que fait-on après l'étape de séquençage en parallèle? (rappel: on a maintenant obtenu la séquence de tous les fragments d'ADN qui ont été amplifiés un puit)

Answer 40

**L'analyse bioinformation:** aligner chacune de ces séquences obtenues au bon endroit du génome humain (en utilisant un génome de référence), et comparer l'ADN du patient avec le génome de référence * Identifier s'il y a des variations de séquence * Déterminer si ces séquences de variation sont pathologiques

Question 41

Vrai ou faux: le plasma d'une femme enceine contient uniquement l'ADN de ses propres cellules à elle

Answer 41

**Faux:** Son plasma contient aussi des quantité d'ADN foetal libre Normalement, environ 10% de l'ADN libre circulant provient du foetus (libéré par les cellules qui ont traversé la membrane placentaire) - et 90% provient des cellules maternelles.

Question 42

Pourquoi est-ce que dans certain cas, est-il préférable de séquencer l'exome vs. le génome?

Answer 42

La majorité des mutations pathogéniques surviennent dans l'exome. Il est donc plus efficace et moins coûteux, dans certains cas, de seulement séquencer l'exome.

Question 43

Qu'est-ce qu'un ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate)? (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)

Answer 43

Nucléotide modifié qui n'a pas de 3'OH Donc: leur incorporation dans un brin d'ADN met fin à l'élongation de ce brin d'ADN