Fragen Enzyme Flashcards
1
Q
- In vielen Enzym-Tests werden nicht die natürlichen Substrate und Produkte
eingesetzt. Warum ?
A
- Viele Produkte sind schwer nachzuweisen. Einige lassen sich nur schlecht messen,
wohingegen andere schwer von den restlichen Substanzen der Reaktion zu
unterscheiden sind. Daher werden gerne Substrate verwendet, die noch vom Enzym
umgesetzt werden, jedoch leicht messbare Produkte liefern. Beispielsweise finden häufig
Substrate Verwendung, die farbige Produkte liefern, die dann photometrisch detektiert
werden können.
2
Q
- Geben Sie ein Beispiel für eine durch eine Hydrolase katalysierte Reaktion !
A
- Hydrolasen katalysieren eine Reaktion, bei der ein Wassermolekül an einer
Verbindungsstelle addiert wird, die ursprünglich durch das Entfernen eines
Wassermoleküls entstanden ist. Beispiele hierfür sind Ester, Peptidbindungen,
glykosidische Bindungen….
3
Q
- Wie werden Substrate im aktiven Zentrum gebunden ?
A
- Das aktive Zentrum ist ein kleiner Teil des Enzyms, bei dem meist ein dreidimensionaler
Hohlraum durch Aminosäuren unterschiedlicher Regionen und Polypeptidketten gebildet
wurde. Das Substrat wird hier durch zahlreiche nicht-kovalente Wechselwirkungen wie
z.B. elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van der Waals
Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen gebunden. Die Spezifität des Enzyms für ein
Substrat hängt dabei von der präzisen Anordnung der funktionellen Gruppen innerhalb
der Bindungsstelle ab.
4
Q
- Du denkst, ein Substrat passt in die Bindungsstelle wie ein Schlüssel ins
Schlüsselloch… Dein Kumpel ist da anderer Meinung, wer hat Recht ?
A
- Beide haben bedingt Recht. Generell passt ein Substrat präzise in die Bindungsstelle wie
ein Schlüssel ins Schlüsselloch. Allerdings ist die Bindungsstelle eines Enzyms nicht
zwangsweise ein starres Konstrukt, sondern kann durchaus flexibel sein. So kann ein
Substrat auch die Form der Bindungsstelle ein bisschen anpassen, eine Hypothese die als
„Induced Fit“ bekannt ist.
5
Q
- Bei einer enzymatischen Reaktion im Reaktionsgefäß kann es zur Einstellung eines
A
- In der Zelle werden die Reaktionsprodukte in Folgereaktionen umgesetzt, daher erreicht
die Reaktion hier kein Gleichgewicht.
6
Q
- Beschreibe die Michaelis-Menten Gleichung ! Definiere alle Parameter !
A
6. V0 = Vmax(S/(S + KM)) Anfangsgeschwindigkeit: V0 Maximalgeschwindigkeit: Vmax Substratkonzentration: S Michaelis Konstante: KM
7
Q
- Was bedeutet Vmax ?
A
- Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit oder Rate der Reaktion bei einer gewissen
Enzymmenge, gesättigt mit Substrat.
8
Q
- Was ist die Obergrenze von kcat / KM ?
A
- Die Diffusionskontrollierte Interaktion von Substrat und Enzym bestimmt die
Obergrenze der Rate. Diese liegt bei 108 – 109
s
-1M-1
.
9
Q
- Wie unterscheiden sich die Zwischenstufen bei Enzymmechanismen mit mehreren
Substraten ?
A
- Bei einem sequentiellen Mechanismus binden beide Substrate und bilden einen
ternären Komplex aus. Bei einem Ping-Pong Mechanismus werden ein oder mehrere
Produkte freigesetzt bevor alle Substrate gebunden sind. Somit werden hier
ausgetauschte Enzymintermediate gebildet.
10
Q
- Nennen Sie ein Beispiel, beidem beide Substrate vor der Katalyse gebunden werden.
A
- Z.B. Laktatdehydrogenase und Kreatinkinase
11
Q
- Denken Sie dass die Reihenfolge der Substratbindung eine wichtige Rolle für die
Enzymkatalyse spielt?
A
- In manchen Fällen, ja. Bei Ping-Pong Mechansimen beispielsweise muss das richtige
Substrat binden um das korrekte Enzymintermediat zu bilden. Bei sequentiellen
Mechanismen kommen sowohl geordnete Substratbindung (z.B. Laktatdehydrogenase),
als auch ungeordnete Substratbindung und Produktfreisetzung vor (Kreatin Kinase).
12
Q
- Wie unterscheiden sich die Typen der Inhibition kinetisch ?
A
- Kompetitive Inhibition kann durch große Mengen an Substrat unwirksam gemacht
werden. Jedoch ist der apparente KM – Wert erhöht. Bei der nichtkompetitiven
Inhibierung kann Substrat an den EI Komplex binden, jedoch ist Vmax vermindert. Bei der
gemischten Inhibierung können beide Werte abweichen.
13
Q
- Was ist ein Affinitätslabel ?
A
- Hierunter versteht man ein Substratanalogon, das strukturell dem Substrat sehr ähnlich
ist, an das aktive Zentrum des Enzyms bindet und chemisch mit einem Rest des aktiven
Zentrums reagiert. Es wird dazu verwendet, die Enzymstruktur und den
Reaktionsmechanismus zu erforschen.
14
Q
- Was sind Übergangszustandsanaloga ?
A
- Diese sehr wirksamen Inhibitoren ahmen die Struktur eines Übergangszustandes im
katalytischen Prozess nach. Sie binden sehr fest an das aktive Zentrum und sind nützlich
bei der Aufklärung der Enzymstruktur und des Reaktionsmechansimus.
15
Q
- Was ist die Herausforderung für eine Protease bei der Hydrolyse einer Peptidbindung?
A
- Die Carboxylfunktion der Peptidbindung ist nicht sehr reaktiv. Die Protease muss
diese Funktion aktivieren um den nukleophilen Angriff von Wasser zu
unterstützen.
16
Q
- Wie können kovalente Modifikationen genutzt werden um den Mechanismus eines
Enzyms zu untersuchen?
A
- Wenn für eine bestimmte Aminosäure angenommen wird, dass diese am
Mechanismus beteiligt ist, führt eine kovalente Modifikation des Restes zu einer
Änderung der Enzymaktivität. Jedoch, muss diese Methode gewöhnlich durch
andere Techniken bestätigt werden (Bsp. ortsgerichtete Mutagenese,
Zirkluardichroismus, …) um auszuschließen, dass der Verlust der Aktivität
beispielsweise durch konformationelle Änderungen verursacht wird.
17
Q
- Warum werden Substratanaloge eingesetzt um die Aktivität von Enzymen zu messen?
A
- Ein Enzymaktivitätstest muss so gestaltet sein, dass der Verbrauch des Substrates
bzw. die Bildung des Produktes schnell und einfach gemessen werden kann.
Substrate die bei der Umsetzung ihre spektralen Eigenschaften ändern, können
somit leicht mit Hilfe eines Spektrophotometers quantifiziert werden.
18
Q
- Worin liegt die Ursache für den „burst“ der Aktivität und die folgende steady-state
Reaktion von Chymotrypsin wenn man den Reaktionsverlauf mit Hilfe eines stoppedflow
Spektrophotometer verfolgt?
A
19. Chymotrypsin spaltet Peptidbindungen in einer Zweischrittreaktion. Dabei ist der erste Schritt (Bildung des Acyl-Enzym-Intermediates) schneller ist als der zweite Schritt (Hydrolyse).
19
Q
- Was unterstützt die Theorie, dass die katalytische Triade ein effektives Mittel ist um
die Hydrolyse von Peptide zu bewerkstelligen?
A
- Zahlreiche verschiedene Enzyme unter ihnen die Peptidasen und einige Esterase
nutzen ähnliche Reaktionsmechanismen. Während die Strategie dieselbe ist, sind
die darin beteiligten Aminosäurereste verschieden. Dies führt zu den Schluss,
dass dieser häufig zum Einsatz kommende Mechanismus das Ergebnis von
konvergente Evolution ist.
20
Q
- Was ist die allgemeine Strategie von Cystein-, Metallo- und Aspartatproteasen?
A
.
Alle nutzen einen Mechanismus bei dem ein Nukleophil gebildet wird, welches
dann die Carbonylfunktion der Peptidbindung angreift.
21
Q
- Was ist das Nukleophil von Cystein-, Metallo- und Aspartatproteasen?
A
Das Nukleophil ist Wasser.
22
Q
- Medikamentenentwicklung zur Inhibierung von Enzymen ist ein wichtiger Bereich der
pharmazeutischen Forschung. Welche Enzymeigenschaften sind in diesem
Zusammenhang interessant?
A
- Enzyme können durch Wechselwirkungen mit einem potentiellen Wirkstoff,
welcher entweder im aktiven Zentrum oder in einer regulatorischen Stelle
bindet, inhibiert werden. Die Struktur von natürlichen Substraten und
Aktivatoren und deren Bindungsstellen sind nützliche Angriffstelle für die
Entwicklung neuer Medikamente. Dabei ist die Bindungsaffinität und Spezifität
wichtig. Mit Enzymaktivitätstest kann der Einfluss der Inhibitoren auf kcat-, KM-,
und Vmax-Werte bestimmt werden.
23
Q
- Wie wird in der Gegenwart von Carboanhydrase Bicarbonat gebildet?
A
- Ein Zinkion unterstützt die Bildung eines Hydroxidions, welches Kohlendioxid
angreifen kann.
24
Q
- Welches Merkmal von Carboanhydrase erlaubt die schnelle Hydratatisierung von
Kohlendioxid?
A
- Die räumliche Annäherung der beiden Reaktanten (Kohlendioxid und Wasser)
und die Gegenwart eines Buffersystems welches die Protonentransferreaktionen
unterstützt.
25
Q
- Welchen Mechanismus nutzen Restriktionsendonukleasen um DNA zu spalten?
A
- Ein aktiviertes Wassermolekül greift direkt das Phosphoratom der
Phospodiesterbindung an.
26
Q
- Die Sequenz der 6 basenpaarlangen Restriktionsschnittstelle von EcoRV ist GATXXX.
Wie lautet die komplette Sequenz der Erkennungsstelle?
A
- GATATC
CTATAG
27
Q
- Warum sind P-loop Domänen und Mechanismen weit verbreitet?
A
- Diese Strukturen sind in der Lage nach Bindung eines NTP große
konformationelle Änderungen durchzuführen und NTP zu hydrolysieren. Diese
strukturelle Vielfältigkeit erlaubt eine breite Spezifität.
28
Q
- Warum sind Metallionen für die Aktivität der meisten NTP-abhängigen Enzyme
notwendig?
A
- Diese Enzyme binden nicht NTP, sondern den Metallionen-NTP-Komplex.
29
Q
- Was ist die Funktion der Aspartattranscarbamoylase?
A
- Das Enzym katalysiert den ersten Schritt in der Synthese von Pyrimidinen. Es
kondensiert Carbamoylphosphat und Aspartat zu N-Carbamoylaspartat und anorganischem
Phosphat zu bilden.
30
Q
- Geben Sie mehrere Beispiele für Enzyme und Proteine, die durch proteolytische
Aktivierung aktiviert werden.
A
- Beispiele sind Verdauungsenzyme (Trypsin), Hormone (Insulin), Gerinnungsenzyme
(Fibrinogen), Entwicklungsprozess Proteinen (Kollagen) und Apoptose-Proteine (Caspasen).
31
Q
- Warum war es überraschend, dass CTP ATCase hemmt?
A
- Die Substrate für ATCase sind Carbamoylphosphat und Aspartat. Diese Moleküle ähneln
nicht CTP. Somit war es klar, dass CTP nicht an der aktiven Stelle, aber dafür an einer
anderen regulatorischen Stelle binden muss.
32
Q
- Folgen allosterische Enzyme der traditionellen Michaelis-Menten-Kinetik? Zeichnen
Sie ein Diagramm der Reaktionsrate relativ zur Substratkonzentration für ATCase und
vergleichen Sie es mit dem Diagramm eines Michaelis-Menten Enzyms.
A
- Nein, ATCase zeigt eine unterschiedliche Kinetik. Eine graphische Darstellung der
Geschwindigkeit gegen Substratkonzentration zeigt eine sigmoidale Kurve, entgegengesetzt
der einfachen hyperbolischen Kurve eines Enzyms das der Michaelis-Menten-Kinetik folgt.
33
Q
- Wie unterscheidet sich das sequentielle Modell von dem symetrischen Modell für
allosterische Enzyme?
A
- Das symetrische Modell erlaubt nichts anderes als eine “Alles-oder-Nichts”- Form des
Proteins (komplett gespannt oder entspannt). Im Gegensatz dazu ermöglicht das
sequentielle Modell eine gemischte Art des Proteins, mit einigen gespannten und
entspannten Untereinheiten. Die Form ist abhängig von der Ligandenbindung an eine
bestimmte Untereinheit.
34
Q
- Warum ist eine kovalente Modifikation im Vergleich zur proteolytische Aktivierung
von Vorteil?
A
- Kovalente Modifikation sind in der Regel ein reversibler Prozess.
35
Q
- Phosphorylierung ist ein äußerst wirksames Instrument für die katalytische Steuerung.
Erklären Sie die Gründe.
A
- Eine Phosphorylgruppe fügt negativen Ladungen hinzu, so dass neue elektrostatische
Wechselwirkungen und neue Wasserstoff-Bindung entstehen können. Die freiwerdende
Energie bei der Phosphorylierung ist groß, wodurch sich das konformelle Gleichgewicht der
verschiedenen Zustände beeinflusst werden kann. Die Verwendung von ATP bedeutet, dass
die Reaktion mit dem Energie-Status der Zelle verknüpft ist. Phosphorylierung ist schnell,
umkehrbar und kann zu verstärkenden Wirkungen führen. Diese Faktoren beeinflussen
strukturelle, thermodynamische, regulatorischen und kinetischen Eigenschaften.
36
Q
- Wie wird die Kinase-Kaskade aktiviert?
A
- Der Prozess wird oft durch Hormone, die an Membran-Rezeptoren binden eingeleitet.
Dieser Prozess aktiviert die Adenylat Cylase, die die Bildung von cAMP, einem intrazellulären
Botenstoff bewirkt. Das cAMP aktiviert eine wichtige Protein-Kinase. In eukaryotischen
Zellen ist dies ein allosterisches Enzym, die Protein-Kinase A, die dann verschiedenen
Zielproteine phosphoryliert.
37
Q
- Wie wird die Blutgerinnungskaskade initiiert?
A
- Sowohl intrinsische (beschädigte Oberfläche) und extrinsische (Trauma) Auslöser können
die Kaskade induzieren. Die ersten Schritte unterscheiden sich hierbei, führen aber letztlich
zu einem abschließenden, gemeinsamen Weg, um die Fibringerinnsel zu bilden.
38
Q
- Was ist der letzte Schritt im Blutgerinnungweg?
A
- Im letzten Schritt wird Fibrinogen, welches sechs Ketten aus drei Typen Untereinheitenenthält,
verändert. Thrombin spaltet vier der Ketten, was zur Bildung von Fibrinmonomeren
führt. Diese Monomere bilden spontan das Fibrinnetz. Das Gerinnsel wird durch
Querverbindungen zwischen den Aminosäuren katalysiert durch Transglutaminase
stabilisiert.
39
Q
- Was ist die zweifache Wirkung von Thrombin?
A
- Zum einen katalysiert Thrombin die Hydrolyse von Fibrinogen um aktives Fibrin zu
bilden. Zum anderen spielt es auch eine Rolle beim Herunterfahren der Kaskade durch
Regulation von Protein C, einer Protease, die die Gerinnungsenzyme Va und VIIIa verdaut
