Examen final 6 Flashcards
Qu’est-ce que la spectrophotométrie ?
-Méthode analytique qui mesure l’absorption de la lumière par une substance en solution
- Chaque molécules présente une spectre d’absorption unique
Qu’est-ce que la signature moléculaire ?
Chaque substance présente un spectre d’absorption qui est unique à lui
Quel est le principe de base de la spectrophotométrie ?
- Lorsque la lumière (I0) passe à travers une solution, une partie sera absorbée
- L’intensité de la lumière transmise (It) sera donc inférieur à I0
Qu’est-ce que la Loi de Beer-Lambert ?
- L’absorbance est proportionnelle à la concentration d’une espèce en solution
A = ECl
Comment on peut utiliser l’absorbance à 600nm pour mesurer la concentration cellulaire, ses avantages et ses limites
-Lumière sera dérivée plutôt qu’absorbée
- on vient mesurer la turbidité ou densité optique
- la quantité de lumière dérivée = la concentration cellulaire de la solution
- On mesure à 600nm parce que c’est l’absorption minimal et sans risque
- Méthode non destructive
- Ne différencie pas les cellules mortes de cellules vivantes
- technique dépend de la sensibilité de l’appareil
Pourquoi on utilise l’absorbance à 280nm pour détecter les protéines en
spectrophotométrie
- Les protéines absorbent entre 200- 400nm
- les aa aromatiques absorbent à 280 nm
- Proportionnelle à la concentration de la protéine en solution
-Biais important selon la quantité d’acides aminées aromatiques dans la protéines
Le principe de la méthode de Bradford, ses avantages et biais possibles
- pour pouvoir obtenir une meilleure sensibilité dans le dosage des protéines par spectrophotométrie
- Méthode de Bradford utilise le bleu de Coomassie. En condition acide se lie avec des AA aromatiques et basique. L’absorption maximale passe de 465nm à 595nm permet d’etre plus dans la lumière du visible
Quels sont les avantages de la méthode de Bradford vs 280 nm
- Beaucoup plus sensible
- Spécificité accrue
- Dans les deux cas biais d’absorption, mais moins dans la méthode de bradford
- Courbe de standard est nécessaire pour la quantification précise
Comment on peut utiliser l’absorbance à 260nm pour mesurer la concentration en acides nucléiques d’un échantillon, ses avantages et ses limites
- Les AN absorbent à 260nm via les doubles liens des bases azotées
- On peut ainsi estimer leur concentration en utilisant la valeur de l’absorbance à 260 nm
- Par contre : interférence importante des protéines à 260nm
- ratio A260 nm / 280 nm indique le degré de pureté de l’ADN
Qel est l’utilité du ratio A260/A280 ?
Permet de qualifier la pureté de l’ADN puisqu’il y a interférence des protéines à 260nm
Utilité du ratio A 260 / A 230
Voir si notre ADN est contaminée avec des sucres, sels ou autres solvants organiques
Qu’est-ce que la fluorescence ?
Processus dans lequel des atomes/molécules sont :
1. Excitées par absorption d’un rayonnement électromagnétique
2. Reviennent à leur état d’énergie initial en libérant l’excès d’énergie sous forme de photon
La différence entre la fluorescence et la phosphorescence
La fluorescence est une émission de la lumière quasi instantanée, s’arrête lorsqu’on retire la source d’excitation
La phosphorescence est l’émission de la lumière à retardement, peut continuer des heures après l’arrêt de l’excitation
Qu’est-ce que la fluorimétrie ?
- Les photons émis sont toujours de plus faible énergie que les photons d’excitation (longueur d’onde plus grande) comme une image miroir imparfaite
- Fluorimétrie = mesure de la fluorescence
- La fluorescence serait plus spécifique que l’Absorbance
Pourquoi est-ce que la fluorescence serait plus spécifique que l’absorbance
- Plus sensible
- Plus spécifique : moins de variations due à la présence d’acides aminées
- De nombreuses applications variés
Comment on mesure la fluorescence
Avec un spectrofluorimètre
Quels sont les facteurs qui influence l’absorption et la fluorescence ?
- pH
- Température
- Présence de solvants, tampons ou autres molécules contaminantes ( faire un blanc)
- Concentration trop élevée ou basse
Nomme des exemple d’application de la fluorimétrie ?
Visualisation d’ADN
Quantification des acides nucléiques à l’Aide de colorants spécialisésq
décrit comment on peut visualiser l’ADN grâce à la fluorimétrie
- ## Sur gel d’agarose (bromure d’éthidium)
Décrit comment on peut quantifier les acides nucléiques à l’aide de colorants spécialisés en fluorimétrie
- Quant-IT PicoGeen dsDNA
- Très sensible
- Très spécifique
Décrit comment on quantifie des protéines grace à la fluorimétrie
- Quant-IT Protein
-Sensible - Très spécifique
- Supposément moins de variations en raison de la composition en acides aminées
À quoi servent les protéines fluorescentes ?
Pour la localisation cellulaire (microscopie), mesure du niveau d’expression d’un gène, suivie de populations microbiennes
Agissent comme colorants
Comment ça marche des protéines fluorescentes ?
Génétiquement, on ajoute notre gène avec la protéine fluorescente avec le gène qu’on désire voir s’exprimé (émettre de la fluorescence)
Qu’est-ce que la chimioluminescence
- Émission de lumière froide par l’excitation d’atomes ou molécules
- Émission de la lumière à la suite d’une réaction chimique
