Examen 5 Flashcards
Quel est le principe de l’électrophorèse ?
Séparation de molécules (protéines ou AN) grâce à des champs magnétiques
Mobilité des molécules est influencée par : taille, charge et forme molécule ainsi que la puissance du champs ou la force ionique
Qu’est-ce que l’électrophorèse sur gel d’agarose ?
-Principe utilisé pour la séparation d’acides nucléiques et surtout ADN
- Séparation surtout selon la taille (PD)
- Pour l’analyse ou la purification
- 4 étapes : 1. Préparation du gel d’agarose, 2. Dépot de l’échantillon, 3. Migration et 4. Révélation
Quelle est la relation entre le % d’agarose, la porosité et la capacité de séparation des Acides nucléiques dans l’électrophorèse par gel d’agarose ?
-Bas % : séparation surtout de grosses molécules car les pores sont de grandes tailles
-Haut % : séparation surtout de petites molécules car les pores de l’agarose vont être de plus petite taille
- Standard = 1%
Quel est le rôle de la solution de chargement, du tampon d’électrophorèse et des standards de masse pour l’électrophorèse sur gel d’agarose ?
- Solution de chargement : possède glycérol pour amener les acides nucléiques dans le fond + permet de mieux faire migrer les composés
- Tampon d’électrophorèse : permet de conserver le pH malgré la présence d’ions pour ne pas venir faire dénaturer les Acides nucléiques
-Standards : Permet d’avoir des fragments d’ADN avec une masse molaire connue, plus facile ensuite pour venir déterminer la masse molaire de fragments inconnus
Comment révéler la présence de molécules d’acides nucléiques après la migration par électrophorèse sur gel d’agarose ?
- Utilisation de colorants qui ont une affinité pour les Acides nucléiques
- Avant c’était le bromure d’éthidium (toxique) maintenant GelRed qui est moins toxique
Qu’est-ce que l’électrophorèse sur gel d’acrylamide ?
-Principalement utilisé pour la séparation des protéines
-En conditions dénaturantes (SDS-Pages) ou non dénaturantes (Natif)
- Surtout analytique (composition, pureté)
- 4 étapes : Préparation du polyacrylamine, Dépot, migration et révélation
Quels sont les rôles du SDS, de la chaleur et des agents réducteurs dans le SDS-Page ?
Ils viennent détruire les liens disulfure des protéines.
Rend la protéine en forme linéaire, plus facile ensuite pour la migration (dénaturation)
Qu’est-ce qu’un gel natif ?
Permet de séparer les protéines dans leurs conditions naturels (sans dénaturation) et dans SDS
Quel est la relation entre le % d’acrylamine, porosité et la capacité de séparation des protéines ?
Plus le % est haut et plus les protéines sont petites
Quel est le rôle de la solution de chargement, tampon électrophorèse et standards de masse dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide
- Solution de chargement : composé de glycérol + colorants pour suivre la migration + SDS
Quels sont les rôles et fonctionnement des gels stacking et resoling (séparateur)
Stacking : faire en sorte que toutes les protéines vont arriver à la ligne en même temps (pH 6.8)
Resoling : les protéines vont s’y séparer (pH8.8)
- Quand on fait entrer nos protéines sur le gel (stacking) des molécules de Cl- viennent pousser les protéines dans le gel. Il va y avoir de la glycine juste avant le prochain gel pour empêcher les protéines de passer.
- Lorsque la glycine arrive à pH 8.8, elle devient éluée ( du à son PI), puis les protéines sont relâchées dans le gel resoling
Comment on révèle la présence de protéines après la migration dans le gel d’acrylamide ?
Avec le bleu de Coomassie
En conditions acides interagit avec les acides aminés aromatique et basique seulement
Sensible, rapide et simple
QU’est-ce que le transfert de protéines sur membranes et le Western Blot ?
- Permet de détecter une protéine spécifique (intérêt)
- Utilisation d’anticorps
spécifique contre notre protéine - On change notre gel sur une membrane avec la présence d’anticorps qui viennent se lier avec notre protéine
- On vient incorporer de second anticorps qui viennent se lier au anticorps précédents
- On peut vérifier notre transfert par des colorants Panceux S
Qu’est-ce que l’électrofocalisation ?
Séparation selon le PI des protéines
Utilisation de gel polyacrylamide avec gradient de pH stable
Migration jusqu’à atteinte PI, après arrête de migrer
Pas de SDS dans la solution parce qu’on sépare selon la charge naturelle de la protéine
