Examen final 4 Flashcards
Quels sont les principes de bases de la chromatographie ?
Ensembles de méthodes qui assurent la séparation des constituants d’un mélange en utilisant deux phases non miscible
Nomme les deux phases de la chromatographie
1.Phase stationnaire: immobile + affinité avec le solutés
2. Phase mobile : entraîne les solutés le long de la phase stationnaire
La séparation dans la chromatographie repose sur quoi ?
Sur l’affinité des solutés avec la phase stationnaire
Si les constituants ont une grande affinité avec la phase stationnaire ?
Migration beaucoup plus lente
Si les constituants ont une faible affinité avec la phase stationnaire ?
Migration beaucoup plus rapide
L’affinité des molécules avec la phase stationnaire influence quoi ?
- leur solubilité dans la phase mobile
- Leur adsorption par la phase stationnaire
Quelle est la différence entre l’absorption et l’adsorption ?
Absorption : molécule va être manger par une autre
Adsorption : liaison de faible énergie assurant la fixation du composé avec la phase stationnaire
Comment classe-t-on les différents types de chromatographie ?
a) selon état de phase (liquide solide)
b) selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire
c) selon le principe des interactions en soluté x phase stationnaire
d) selon la modalité de migration de la phase mobile
Qu’est-ce que la chromatographie sur couche mince ?
(penser au cercle sur feuille)
- Chromatographie liquide
- La phase stationnaire est fixée sur plaque et polaire (gel de silice)
- Phase mobile qui migre par capillarité et moins polaire
- adsorption par forces électrostatiques (polaire / non polaires)
- permet de contrôler facilement et rapidement la pureté d’un composé organique
- Très utile pour rechercher le meilleur solvant avant de faire chromatographie de colonne
Qu’est-ce que le Rf ?
Le rapport frontal
Qu’est-ce que les différentes valeurs de Rf signifient ?
Rf faible : composé polaire
Rf élevée : composé apolaire
Comment on calcul le Rf
d(soluté) / D (solvant)
D et d : distance entre ligne de dépot + front de migration
La différence entre la migration direct et indirect
Direct : composé naturellement colorés
Indirect : UV, révélateurs chimiques
Qu’est-ce que la chromatographie sur gel ?
-Méthode de séparation basée sur la taille des solutés qui utilise un tamis moléculaire
- Phase stationnaire : microbilles poreuses
- Séparation basée sur la capacité des molécules à diffuser à travers pores
- Il n’y a aucune liaison moléculaire entre soluté x phase stationnaire
- Les plus petites molécules vont migrer plus rapidement
Qu’est-ce que la capacité de fractionnement dans la chromatographie sur gel ?
Montre la capacité du gel à séparer des protéines d’un certain poids moléculaire
Qu’est-ce que la Limite d’extraction représente dans la chromatographie sur gel ?
La plus grand taille de pm qu’une molécule peut avoir dans le gel, sinon elle sera automatiquement éluée
Qu’est-ce que le kav ?
-Soluté est distribué entre l’eau interne et l’eau externe
Comment on calcul le kav ?
Kav = (Ve - Vo) / (Vt - Vo )
Que signifie les différentes valeurs de Kav ?
K = 0 : soluté est totalement exclus
K entre 0 et 1 : soluté est partiellement exclus
K = 1 : inclusion totale
K > 1 : soluté est inclus + absorbée
Qu’est-ce que la chromatographie d’affinité ?
- repose sur interaction spécifique entre 2 molécules (affinités)
- Soluté à séparer se fixe réversiblement à un ligand spécifique attachée à une matrice insoluble
- En condition non-dénaturantes
- Nécessite une connaissance prélimminaire de la structure et de la spécificité biologique du composé à purifier ou on utilise des tags
Qu’est-ce que la chromatographie d’affinité IMAC ?
- centre métallique immobilisé sur la phase stationnaire
- Affinité entre la protéine + atome métallique
- Utilisation d’étiquette
Pourquoi est-ce qu’on utilise des étiquettes en chromatographie d’affinité ?
Les étiquettes permettent de faciliter la purification de protéines en créant une liaison spécifique et contrôlable
Qu’est-ce que la chromatographie hydrophobe ?
- Séparation selon le degré d’hydrophobicité des composantes
- Phase stationnaire : résines qui portent des groupements hydrophobes
- Phase mobile : tampons avec des gradient s de concentration en sel ( + vers - )
- On force ;es parties hydrophobes des protéines à s’exposer et interagir avec la matrice
- Plus une protéine est hydrophobe et moins elle a besoin de sels pour interagir
- Élution en ordre croissant d’hydrophobicité
À quoi sert les sels dans la chromatographie hydrophobe ?
Les sels favorisent les interactions hydrophobes (compétitionnent avec les protéines pour les molécules d’eau)
Faire attention : si on mets trop de sels = formation d’aggrégats
