Eiwitsynthese Flashcards
van RNA naar eiwit
= translatie
1) degeneratieve genetische code: 61 codons voor 20 AZ
- 3 = stopcodon = UAA, UAG, UGA
- meerdere codons voor een aminozuur
- meestal gelijkenissen in laatste nucleotiden
2) leesraam = open reading frames
- meerdere mogelijkheden maar meestal maar 1 mogelijk
- per 3 codons lezen
- kleine afwijkingen: mitochondrionaal DNA = onafhankelijke translatie
mechanisme
1) koppeling van tRNA aan AZ
2) koppeling van tRNA aan mRNA
3) vorming van eiwitketen
tRNA
= adapter voor AZ
1) structuur
- 80nucleotiden
- 4 segmenten vormen lusvorm: 3’ einde met AZ, T-loop, anticodon & D-loop
–> vorm van klavertje 4
–> lussen = gedeeltelijke dubbele helix
- verdere opvouwing tot L-structuur = additionele H-bruggen tussen T & D lus
codon = 3’ - 5’ –> anticodon 3’ -> 5’
2) gebruik
- anticodon = complementair aan mRNA
–> tRNA bevat AZ voor complementair mRNA
- meerdere tRNA moleculen voor AZ bij verschillende codons
- 1 tRNA molecule voor AZ bij codons waarvan enkel eerste 2 nucleotiden van belang zijn = mismatch = wobble
3) voorkomen in organismen
- bacterieën = 20AZ, 61 codons, 31 tRNA’s
- mensen = 20AZ, 61 codons, 48 tRNA’s
–> wel 500 genen
tRNA synthese
1) aanmaak door polymerase III
2) inkorting door tRNA splicing
3) covalente modificaties
- 1/10 nucleotiden
- 50 soorten modificaties
- beïnvloeding passing van codon x anti-codon = beter herkenning
- vb: demanitatie van adenosine -> inosine
4) transport buitencelkern
5) hecting van tRNA aan juiste AZ
- aminoacyl-tRNA synthesasen
- bacterie = 1
- eukaryoten = specifiek per aminozuur
- 2e enzym voor verbreking van verkeerde koppelingen
- covalente koppeling aan 3’ uiteinde = ATP verbruik voor hoog energetische binding
–> energie gebruiken voor spontane eiwitsynthese
koppeling van AZ
1) ribosomen
- miljoenen in eukaryotische cel
- kleine subeenheid = herkenning codon x anti-codon
- grote subeenheid = vorming polypeptide binding
–> dissociatie tijdens geen eiwitsynthese
2) delen van ribosoom
- A-site = ontvangen van tRNA
–> binden aan polypeptideketen
- P-site = tRNA aan gebonden aan groeiende keten
–> ontbinden van tRNA
- E-site = exiting van tRNA
3) peptidebinding vormen tussen
- afla-carboxylgroep van groeiend eiwit
- alfa-aminogroep van vrij aminozuur
- van N-terminus naar C-terminus
mechanisme van AZ koppeling
- 5’ einde mRNA = associatie grote & kleine subeenheid
- startcodon
- begin eiwitsynthese
- N-terminus van eiwit - eerste cycli
- binding van tRNA op A of P site
- beide zorgen voor juiste associatie
- vorming binding tussen groeiend eiwit & AZ
- translocatie naar volgend codon
- binding elongatie factoren - reactie cyclus
- binding tRNA op A site
- binding op groeiend eiwit
- tRNA covalent gebonden aan C-terminus in P site
- doorschuiven naar E - site = verlaten
- door peptidyltransferase - stopcodon
- loslaten eiwit
- dissociatie subeenheden
proofreading van eiwitsynthese
1) elongatie facotren
- elke cyclus binden & terug verlaten
- bacterieel = EF-Tu & EF-g, eukatryoot = EF-1 & EF-2
–> EF-G = correcte locatie van ribosoom
1) binding GTP & aminoacyl-tRNA = gebogen binding
2) naar ribosoom brengen & controle juiste AZ op tRNA
3) gebogen binding laat codonparing toe maar nog geen incorperatie van AZ
4) correct codon = GTP hydrolyseren
5) loslaten binding EF-Tu & AZ, vorming binding AZ & eiwit
2) ribosoom zelf
- kleine subeenheid ondergaat H-bruggen met codon & anticodon
- aantal H-bruggen bepaalt correctheid
3) positionering
- tRNA moet zich juist positioneren
- foutive tRNA vindt juiste positie niet snelgenoeg & heeft kleine affiniteit dus zal dissocieren
=> accuratesse van 99,99%
start van eiwitsynthese eukaryoot
belang
- bepalen van leesraam
- bepalen wel/niet synthese
- startcodon: AUG = methionine & formylmethionine in bacteriën
- altijd aan N-terminus maar meestal verwijderen door proteasen
process
1. met-rRNAi = initiator tRNA-methionine complex
2. binding op kleine eenheid & P-site van grote = enige tRNA dat op kleine kan binden
3. 5’ herkenning door eIF4E & eIF4G initiatie factoren op 5’ kap
4. zoeken naar AUG door additionele eIF’s
- eIF’s = ATP verbruikende helicase
- cosac-sequentie 5’-ACCAUGG-3’
5. AUG = start
- dissocieren eIF’s
- vorming ribosomaal complex
- tRNAi blijft op A&P site
7. 10% = eerste AUG overslaan
- leaky scanning
- gelijkaardige eiwitten met andere N-terminus
- gelijkaardige functie/pathway
- afh vn nucleotiden rond startcodon
start van eiwitsynthese bacterie
= geen 5’ kap
1) Shine-Dalgarno-sequentie
- enkele nucleotiden stroomopwaarts
- herkenning door nucleosoom
- AGGAGGU
2) herkenning van ribosoom
3) basenpaar vorming mat 16S RNA van kleine subeenheid
4) correctie positionering ribosoom
5) translatiefactoren zorgen voor associatie van grote subeenheid
bacterieën = vaker polycitronisch = verschillende eiwitten vanaf zelfde mRNA streng
einde van eiwitsyntese
1) stopcodon = UAA, UAG, UGA
2) geen tRNA die stopcodon herkent
3) op A-site
- release factors forceren peptidyltransferase te stoppen
–> tRNA nabootsen
- watermolecule incorperen = hydrolyseren van C-terminale einde
4) einde
- eiwit in cytosol
- dissociatie van ribosoom (subeenheden) & mRNA
snelheid van eiwitsynthese
prokaryoten = 20AZ/s
eukartyoten = 2AZ/s
–> eiwit = enkele seconden/minuten
versnellen
1) polyribosomen = polysomen
- complexen van meerdere ribosomen
- max 80 nucleotiden van elkaar verwijderd
- meerdere translatie-initiaties
2) bactierieel mRNA ≠ processing & geen celkern
- begin van translatie voor stoppen transcriptie
+ interactie van 5’ & 3’ uiteindes
- dissociatie van ribosoom = terug kunnen beginnen
antibiotica
1) verschillen in machinerie eukaryoten & prokaryoten
2) bacteriën = prokaryoten, gistcellen = eukaryoten maar overleven in zelfde milieu = competitie
3) productie van bacteriële inhibitoren door gistcellen
–> meestal door binding in holte rRNA molecules
4) inhibitoren = goed voor bacteriele infecties & hoge innames zijn mogelijk
- chlooramefincol = inhibitie van eiwitsynthese in mito
- cycloheximide = inhibitie enkel in ribosomen
- puromycine = analoog van aminoacyl-tRNA = herkennen & incorperen = stoppen synthese
–> zowel pro & eukaryoten
kwaliteit controles bij translatie
- normaal = enkel goede mRNA uit celkern
- foutive processing = soms verlaten van celkern
- schade oplopen of breken in cytoplasma
- nood aan backup - 5’ kap
- begin van translatie-initiatie machinerie
- controle voor breuken - EJC exon junction complex
- op plaatsen waar splicing zou moeten gebeuren = toevoeging bij passage NPC
- controle goede splicing
- krachtigste = nonsense mediated mRNA decay
- eliminatie na merken voorkomen
1) passage door NPC
2) 5’ kap wordt herkend door ribosoom
3) ribosoom verwijderd tijdens passage EJC gebonden aan splicesites
4) ribosoom stagneert bij laatste exon voor stopcodon = geen overige EJC mogen nog aanwezig zijn
5) stagnerend ribosoom botst tegen EJC = stoppen
–> controle van mRNA door eerste translatie ronde
opvouwing van eiwitten
- algemeen
- 3d structuren = hydrofobe kern
- binding cofactoren
- actief worden door modificaties van enzymen vb: kinase
- informatie door AZ sequentie zelf = specifiek opvouwingspatroon - cotranslationele opvouwing = net na veralten ribosoom
- startent aan N-terminus
- volledig opgevouwen bij einde translatie - chapperonnes = enkel eukaryoten
- medieren opvouwing
- verwijderen verkeerde opvouwing
- heat shock eiwitten = toename na denaturatie door temp
- ATP verbruik
- herkenning hydrofobe delen aan opp
- door slechte opvouwing of niet vinden andere complexen
- gevaar voor cel = aggregaat vorming
soorten chapperones
1) HSP70
- actief vanaf begin eiwitsynthese
- herkennen van 7hydrofobe AZ
- ATP hydrolyse = binding & loslaten tot correct eiwit
2) HSP60
- actief vanaf volledig eiwitten
- ruimte in eiwit = voorkomen aggregatie met andere eiwitten
- terug correct opvouwen
3) verwijdering van eiwitten door proteolyse door proteasoom
proteasoom
in competitie met chapperones
- lengte van onopgevouwde eiwitten bepaald fractie van eiwitten dat afgebroken wordt
1) binnenkant
- complex van proteases
- ATP verbruik
- 1% van alle eiwitten
- 20S kernproteasoom = holle cilinder
- eiwitten vormen heptameer -> 4 heptameren vormen cilinder
–> proteasen met actief centrum naar binnenkant
2) uiteindes = kapcomplex
- ATP verbruik
- 19S kap
- ring van 6 eiwitten
- eiwit ontvouwen vooraleer degeneratie = AAA eiwitten & eiwit unfoldases ≈ DNA helicases
- processief karkater = mogelijkeheid tot dissociatie van volledig eiwit tot kleine peptiden
