Diagnostic moléculaire Flashcards
Définir le diagnostic moléculaire
Diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes ou de l’épigénome
Quels sont les deux types de variabilité du génome ?
- Variabilité non-pathologique : divergence de la séquence d’ADN n’étant pas associée à une pathologie génétique
- Variabilité pathologique : changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique
Vrai ou faux ? Il existe peu de tests diagnostiques disponibles en génétique
Faux, il en existe plus de 60 000 ; près de 10 nouveaux tests sont disponibles chaque jours
Vrai ou faux ? La fréquence des variations génétiques est plutôt faible dans la population
Faux
- Chaque individu à 5-6 millions de variations génétiques, dont environ 70 sont de novo
- Toutefois, la plupart de ces variations n’ont pas d’impact phénotypique
Combien de liens H y a-t-il entre C et G ? Entre A et T ?
- C-G : 3 liens hydrogène
- A-T : 2 liens hydrogène
Pourquoi la plupart des variations génétiques n’ont pas d’impact phénotypique ?
- Surviennent dans des régions non-codantes sans affecter l’expression du gène
- Polymorphismes fréquents (SNPs)
- Touchent un gène récessif sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le gène
Nommer des causes externes de variation génétique
- Radiation
- UV
- Chimique (ex. agents alkylants)
Nommer des causes internes de variation génétique
- Dépurination
- Déamination
- Radicaux libres
- Erreurs de la polymérase
- Erreurs de réplication/recombinaison
- Méthylation
Pourquoi les ilôts CpG sont-ils des endroits de prédilection pour les mutations ? Décrire le mécanisme
- C devient méthyl-C
- Méthyl-C devient U
- U devient T
Donc, CG devient TG (20x plus fréquent que les autres mutations)
Distinguer les types de variations non-pathologiques du génome selon leurs tailles
- Grandes : CNV, LINE
- Moyennes : microsatellites
- Petites : SNP, indels
Distinguer les types de variations pathologiques du génome selon leurs tailles
Grands réarrangements
- Insertions
- Délétions
- Équilibrés
Petits réarrangements
- Délétions
- Insertions (mutations dynamiques)
- Substitutions (transitions, transversions)
Quel type de mutation pathologique est le plus fréquent ?
Substitution
ensuite, petites délétions et épissage
Nommer les 4 conséquences possibles des variations dans la séquence d’ADN
- Homologue (silencieux) : change un codon pour un autre qui code pour le même acide aminé
- Faux-sens (missense) : change un codon pour un autre qui code pour un acide aminé différent
- Non-sens (nonsense) : change le codon pour un codon stop
- Altération du cadre de lecture (frameshift) : insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3 = modification du codon et de ceux en aval
Vrai ou faux ? Les mutations non-sens et frameshift sont habituellement pathologiques
Vrai
- Les mutations homonymes sont habituellement bénignes
- Les faux-sens sont variables
Nommer les 5 éléments à considérer pour la pathogénicité d’une mutation
- Fréquence dans la population
- Conservation (dans la nature)
- Impact sur l’ARNm
- Impact sur la protéine
- Fonction du gène
Distinguer gène dominant VS récessif
- Dominant : phénotype exprimé à l’état hétérozygote
- Récessif : phénotype exprimé à l’état homozygote seulement
Distinguer perte et gain de fonction via une mutation
- Perte de fonction : réduction dans la quantité ou l’activité de la protéine entraîne le phénotype
- Gain de fonction : augmentation dans la quantité ou l’activité de la protéine ou l’acquisition d’une nouvelle fonction entraîne le phénotype
Nommer les 5 mécanismes associés aux gains de fonction
- Augmentation du dosage génique
- Altération de l’expression de l’ARNm
- Activité accrue de la protéine
- Nouvelle fonction de la protéine
- Altérations toxiques de la protéine
Vrai ou faux ? On utilise un échantillon de sang pour isoler l’ADN via les globules rouges
Faux, les seules cellules nucléées du sang sont les leucocytes, c’est donc eux qu’on utilise pour isoler l’ADN
Décrire la technique des sels chaotropiques pour l’isolation de l’ADN ; quels sont ses avantages ?
ADN adsorbe sur une colonne de verre/membrane
- Non-toxique et automatisable
Nommer les deux manières d’évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN
- Densité optique : estimation de la quantité de l’ADN, sachant que ratio 260/280 estime la pureté (260 = absorbance max ADN, 280=absorbance max protéines)
- Teintures intercalantes : composés qui se fixent à l’ADN double brin, permet d’estimer la quantité et la taille de l’ADN
En quoi consiste l’électrophorèse capillaire ?
Séparation des molécules d’ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel (ex. agarose)
Nommer un exemple de techniques de base de diagnostic moléculaire sur l’ADN génomique
Buvardage Southern (Southern Blot)
Nommer des exemples de techniques de base de diagnostic moléculaire sur produits de PCR
- PCR-migration
- PCR-digestion
- PCR-séquençage
- PCR en temps réel
- Allèle-specific oligonucleotides
- ASPE
- MLPA
En quoi consiste le buvardage Southern ?
Technique qui combine l’électrophorèse sur gel de l’ADN génomique fragmenté à l’hybridation par sonde complémentaire à l’ADN cible
Nommer les étapes du buvardage Southern
- Digestion de l’ADN génomique
- Électrophorèse capillaire
- Transfert sur membrane
- Hybridation
- Détection par autoradiographie
Vrai ou faux ? Le buvardage Southern permet de quantifier les grandes expansions
Vrai
Nommer les différentes composantes de la réaction PCR
- ADN du patient
- Amorces
- Polymérase
- Nucléotides
- Tampon (Mg, ions)
Est-ce que la PCR est fiable à 100% ?
Non, il existe toujours un petit risque que la polymérase Taq fasse une erreur et ajoute donc un artéfact
Quelle formule permet de calculer le nombre de molécules d’ADN produites à chaque cycle de PCR ?
Nombre de molécules d’ADN : 2^n, où n=nombre de cycles PCR
La quantité d’ADN double à chaque cycle
Décrire la PCR-migration
- Permet de détecter des insertions ou délétions
- Électrophorèse capillaire des produits de PCR et détection du signal : la distance de la bande reflète sa taille
Donner des applications de la PCR-migration
- Analyses d’identité génétique (judiciaire, contamination foeto-maternelle..)
- Insertions et délétions récurrentes
Décrire comment on parvient à savoir s’il y a eu ou non contamination foeto-maternelle
Via PCR-migration, on regarde sur l’ADN foetal si les deux allèles maternels sont présents : normalement, on devrait seulement avoir un allèle identique (l’autre vient du père)
Décrire la PCR-digestion
Digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique : la mutation crée ou abolit le site de restriction
Donner des applications de la PCR-digestion
Mutations ponctuelles récurrentes
- On doit d’abord connaître la mutation recherchée avant le test
Ex. on va voir une bande à 150bp et une autre à 300pb au lieu d’en voir une seule plus foncée à 150pb
Décrire la technique d’ASPE (Allele Specific Primer Extension)
Amplification PCR, puis jeu d’amorces marquées par fluorescence dont certaines ont un mismatch 3’
Comment procède-t-on au séquençage Sanger ?
- Amplification PCR
- Dénaturation
- Réamplification avec mélange de nucléotides et nucléotides modifiés, marqués par fluorescence (incorporation aléatoire)
Distinguer les dNTPs et les ddNTPs
Les ddNTPs n’ont pas de -OH sur le carbone 3’ du ribose, ce qui empêche la liaison du prochaine dNTP (chain termination)
Donner des applications du séquençage Sanger
- Gènes avec grand nombre de mutations dispersées à-travers du gène
- Méthode de choix pour substitutions
- Bonne méthode pour petites insertions ou délétions
Ne permet pas de détecter les grandes anomalies de dosage
Décrire la technique de PCR temps-réel
Réaction de PCR avec détection du produit simultanée, permet discrimination allélique et quantification
Comment fonctionne la PCR temps-réel ?
La sonde est composée d’un rapporteur et d’un “quencher”, qui empêche l’appareil de détecter la fluorescence
- La sonde se lie à l’ADN avec l’amorce
- La Taq libère le rapporteur, ce qui génère la fluorescence
Comment interprète-t-on le PCR temps-réel quantitatif ?
On fixe un seuil arbitraire, et selon le nombre de cycles auxquel on atteint le seuil, on peut trouver la quantité d’ADN de départ
Décrire la technique de MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification)
Méthode pour la recherche de délétions/duplications, sonde en deux sous-unités qui doivent s’hybrider côte-à-côte sur l’ADN du patient. La ligase scelle ensuite les 2 sous-unités, puis amplification PCR et électrophorèse capillaire
À quoi sert le séquençage de nouvelle génération (SNG) ?
- Permet de multiplier l’information obtenue d’une analyse
- Permet d’anlyser plusieurs gènes, voire plusieurs patients en même temps grâce au codes-barre moléculaires
Comment se fait la fragmentation de l’ADN dans le séquençage de nouvelle génération ?
- Sonication
- Nébulisation
- Digestion
Qu’est-ce qu’un code-barre moléculaire ?
Séquence d’une 15aine de nucléotide aléatoires qu’on lie à l’ADN d’un patient et qui permet donc de l’identifier par la suite
Nommer les étapes du séquençage nouvelle génération
- Fragmentation de l’ADN
- Liaison d’adapteurs (code-barre moléculaire)
- Capture
- Amplification en parallèle
- Séquençage en parallèle
Donner les deux techniques d’amplification en parallèle
- PCR-émulsion : comme eau et huile, l’émulsion fait que les ADNs se séparent dans les différentes micelles
- PCR-cluster : utilisation d’une plaque avec adaptateur de séquençage
Décrire le rôle de l’analyse bioinformatique dans le séquençage nouvelle génération
- Procèder à l’alignement des séquences de 100/150 paires de bases générées (plusieurs milliers)
- Identifier si des variations de ces séquences sont présentes
- Déterminer si certaines de ces variations sont pathologiques et situées dans des gènes qui pourraient expliquer le phénotype du patient
Nommer deux exemples d’application du séquençage de nouvelle génération
- Exome
- ADN foetal circulant (produit par l’unité placentaire, circule dans plasma de la femme enceinte)
Définir exome
C’est le 1% du génome qui contient les exons (régions codantes)
