Cours 8 - Stratégie d'introduction de gène in vivo/vitro (complet) Flashcards
Nommer les 3 catégories de stratégie d’introduction de gène dans une cellule
1) Force physique (ex. billes d’or)
2) Produits chimiques (liposomes)
3) Vecteurs viraux (transfection et transduction)
Décrire les trois méthodes d’introduction physique
1) Microinjection (schéma diapo 7) : avec aiguille de verre, rarement utilisée pcq demande bcp de dextérité
A ; ADN incorporé au génome
I ; Difficile à exécuter, une seule cellule injectée à la fois
2) Électroporation (schéma diapo 10) : impulsion électrique qui induit formation de pores sur la membrane cell, qui servent de porte d’entrée à l’ADN
A ; In vitro et in vivo, contrôle spatio-temporel de l’expression, et contrôle du niveau d’expression (en variant la force et le motif du champ électrique), plusieurs types cellulaires
3) Biolistique (schéma diapo 17) : utilisation d’un fusil à gène, qui tire un mélange de particules de métaux lourds (or ou tungstène) et d’ADN collés sur une balle en plastique par polarisation, et tirés par du gaz pressurisé.
A ; Cellules transfectées sont dispersées, permet introduction ADN dans structure épaisse (ex. tranche de cerveau)
I ; In vitro slm, peut causer dommages importants à cellule
Décrire les deux méthodes de transfection chimique, et donner les avantages et inconvénients
1) Par phosphate de calcium (schéma diapo 23) : deux solutions, une de chlorure de calcium (ions calcium), l’autre de tampon salin d’HEPES (ions phosphates).
Ions Ca2+ (positifs) lient ADN et ions PO4- (négatifs) et forment un précipité, qu’on mélange ensuite aux cellules qui l’incorporent
A ; Facile, fiable, pas cher, utile pour expression transitoire
I ; Efficacité faible pour neurones (1 à 3% transfectés), slm in vitro
2) Par lipides (schéma diapo 26) : liposome (structure vésiculaire avec composition lipidique similaire à celle memb cell) entoure l’ADN. Endocyté ou fusionne directement avec membrane.
A ; Fonctionne avec bcp types cell (dont neurones), très rapide (transfection moins de 30min, expression quelques heures)
I ; Slm in vitro
Vrai/Faux : les transfections chimiques sont à court terme, les physiques à moyen/long terme et les virales à long terme uniquement
Faux ;
Physique = court terme
Chimique = court/moyen terme
Viral = moyen/long terme
Résumer les étapes de production archétypique de vecteurs viraux
1) Transfection d’ADN codant vecteur viral dans cellules en cultures
2) Prod virus dans cell en cultures, et relâchement de celui-ci dans milieu de culture
3) Centrifugation du milieu de culture pour collecter virus
Donner les caractéristiques générales de l’adénovirus et schématiser brièvement sa production
- Peut contenir ADN de petite à moyenne taille (7.5 à 30 kb)
- ADN pas intégré au génome cible (expression transitoire sur semaines ou mois)
- Peut causer réponse inflammatoire et mort cellulaire
Schéma diapo 34 (généraliser entre les 4 techniques)
Donner les caractéristiques générales du virus adéno-associé (AAV) et schématiser brièvement sa production
- Peut contenir ADN de petite taille (moins que 5 kb)
- Incapable de s’autorépliquer (plus sécuritaire), donc a besoin d’un virus “helper” pour se multiplier
- ADN s’intègre dans génome cellule cible (expression à long terme)
- Moins toxique qu’adénovirus
- Production très laborieuse
Schéma diapo 36
Donner les caractéristiques générales du lentivirus et schématiser brièvement sa production
- Peut contenir ADN de petite taille (8 kb)
- Rétrovirus d’ARN (ATTENTION), donc possède transcriptase inverse pour produire ADN complémentaire (ADNc)
- ADNc intégré au génome cible (expression long terme)
Schéma diapo 39
Donner les caractéristiques générales du virus herpès simplex (HSV)
- Peut contenir ADN grande taille (plus de 30 kb)
- Neurotrophique (cible naturellement neurones)
- ADN pas intégré dans génome cible, mais existe dans noyau sous forme stable (expression long terme)
- Difficile à produire
- Toxique (pour les cellules et l’expérimentateur)
Construire un tableau d’avantages et inconvénients des techniques mécanique, chimique et virale
Voir diapo 42
Donner les techniques correspondantes à l’introduction en culture cellulaire, en cell isolée, en tranches de cerveau et in vivo (animal)
Culture cellulaire : électroporation, biolistique, chimiques et virales
Cell isolée : microinjection, électroporation
Tranches de cerveau : électroporation, biolistique et virales
In vivo : électroporation et virales
Définir la technique de culture cellulaire et ses avantages par rapport aux techniques in vivo
Faire proliférer et maintenir des cellules isolées d’un animal ou d’un humain dans des conditions contrôlées
- Environnement simplifié
- Contrôle plus important des conditions d’expérimentation
- Réduction des interactions avec d’autres structures
- Expériences en parallèle avec un nombre constant de cellules
- Plus rapide, moins dispendieux, plus petit nombre
d’animaux requis
Nommer les trois types de cellules utilisées en culture
1) Lignées de cellules immortalisées
2) Cellules primaires
3) Cellules souches
Nommer et donner la fonction générale de tous les équipements utilisés en culture cellulaire
1) Hotte biologique : prévient contamination
2) Incubateur : maintient de conditions strictes (ex. température, humidité, concentration CO2, etc.)
3) Pétris/boîtes/lamelles : milieu pour les cultures, supportent nutriments, permettent adhésion, etc.
4) Réfrigérateur : refroidissement du milieu de culture pour maintenir l’activité des facteurs de croissance et les antibiotiques
5) Bain-marie : à 37°C, réchauffe milieu et/ou réactifs si besoin
6) Microscope : observation
7) Milieu de culture : ce qu’on met dans pétri, fournit nutriments et énergie, on peut ajouter antibiotique pour sélectionner les cellules survivantes
Pour neurones, on utilise NEUROBASAL
Qu’est-ce que la confluence cellulaire
L’importance de la croissance cellulaire sur le pétri, si le pétri est couvert de cellules par exemple, on dira que la confluence est de 100%
Donner les caractéristiques principales des lignées cellulaires immortalisées, et leurs avantages vs inconvénients
- Modifiées pour pouvoir se diviser indéfiniment, gardées en culture à long terme.
- Dérivées d’anomalies chromosomiques ou de mutations.
- Confluence très élevée
A ;
- Très bien caractérisées
- Homogènes, constituent population génétique identique (en théorie)
- Plus facile à cultiver que cell primaires
- Croissent très vite (possibilité d’extraire bcp protéines pour tests)
I ;
- Ne sont pas des cell normales vu que motif génétique non exprimé dans cell in vivo
- Caractéristiques cell modifiées après certaine période de prolif
Qu’y a-t-il de spécial à propos de la lignée de cellules immortalisées PC12?
À l’ajout de NGF, se différencient réversiblement en neurones, qui synthétisent catécholamines, dopamine et norépinéphrine et expriment enzymes impliquées dans synthèse de neurotransmetteurs
Donner les caractéristiques principales des cellules primaires, et leurs avantages vs inconvénients
- Cellules ou tissu prélevé directement d’un animal
- Trois types : cultures dissociées, explants, et tranches de tissu
A ;
- Isoler pop spécifique pour examiner fonction cell spécifique
- Examiner impact pharmaco molécules sur fonction cell
- Examiner effets modifs génétiques sur cell
I ;
- Survie cell limitée
- Âge animal a influence (plus jeune = cellules plus robustes et saines)
Décrire brièvement les cultures de cellules primaires dissociées et ses avantages/inconvénients
Dissociation mécanique et/ou enzymatique d’une pop cell spécifique pour l’isoler, avec :
- Immunopanning ; anticorps contre protéine spécifique à type cell dans pétri, sélectivité
- Cytométrie de flux
A ;
- Neurones retiennent identité de région d’origine
- Neurones peuvent être maintenus des semaines, et maturer
- Examiner neurones individuels
- Étudier mécanismes moléculaires
I ;
- Perte organisation et connections in vivo
- Petite quantité de cell, limite études biochimiques
Décrire brièvement les cultures de cellules primaires en tranches et ses avantages/inconvénients
Littéralement des tranches de tissu (ex. tranches de cerveau)
A ;
- Conservation structure et organisation in vivo
- Accès à structures sous-corticales profondes
Quelle est la différence entre des tranches aigues et organotypiques?
Aigues sont utilisées directement en électrophysiologie, alors qu’organotypiques sont maintenues en culture à moyen terme pour étudier changements morphos, migration neuronale, formation axone, etc.
Décrire brièvement les cultures de cellules primaires en explants et ses avantages/inconvénients
Préparation à mi-chemin entre dissociées et tranches.
A ;
- Organisation précise non-conservée, mais même composition cell que tissu in vivo
- Cell forment groupes cohérents plus petits que tranches
Construire un tableau comparatif entre la culture de lignées immortalisées et de cell primaires
Voir diapo 75
Pourquoi peut-on dire que les cellules souches sont une combinaison des cellules primaires et immortalisées?
Pcq elle peuvent se diviser infiniment, et elles proviennent d’un organisme vivant
Vrai/Faux : des cellules souches cultivées dans un milieu sans facteur de croissance perdront éventuellement leur habilité à se renouveler
Vrai
Décrire les trois types de cellules souches vues en classe
1) Embryonnaires : proviennent de la masse interne du blastocyste, selon les conditions, elles peuvent se différencier en cellules progénitrices neurales (ex. SHH et acide rétinoïque = motoneurones ; SHH et FGF8 = neurones dopaminergiques, etc.)
2) Neurales : extraites de zone sous-granulaire gyrus denté de l’hyppocampe, et zone sous-ventriculaire du mur des ventricules latéraux, puis centrifugation, prolifération, et différenciation si on enlève facteurs de croissance
3) Pluripotentes induites (schéma diapo 87) : cell différenciées manipulées pour les ramener au stade de cell souches, virus utilisé pour produire 4 facteurs de transcription qui permettent de perdre phénotype différencié.
