Cours 6 - Visualisation de structures du système nerveux (complet) Flashcards
Nommer les 4 étapes de préparation des tissus neuraux
1) Fixation
2) Dissection
3) Enveloppement
4) Sectionnement
Définir le processus de fixation, et pourquoi il est nécessaire
Utilisation de produits chimiques pour préserver, stabiliser et renforcer échantillon pour analyses micro
- Renforcer interaction moléculaires
- Désactiver enzymes protéolytiques
- Éliminer microorganismes de dégradation
Nommer les deux agents et modes de fixation
Agents :
1) Cross-linking : formation liaisons covalentes
- Avec aldéhydes (micro photonique)
- Avec terroxide d’osmium (micro électronique)
2) Déshydratation : perturbation lipides, réduction solubilité protéines (méthanol, acétone)
Modes :
1) Immersion : temps varie selon taille/épaisseur tissu
2) Perfusion transcardiaque : pénétration ventricule gauche sous anesthésie
Comment est-ce que l’eau peut endommager tissus lors de la congélation? Et que fait-on pour y remédier?
Lorsqu’elle gèle, eau forme des cristaux qui peuvent couper tissus.
On submerge dans solution de 30% sucrose
Définir l’étape d’enveloppement, et les milieu utilisés
On met le tissu dans une enveloppe pour stabiliser la structure du tissu, et faciliter les coupes
- OCT compound (Optimal Cutting Temperature)
- Gélatine
- Paraffine
- Plastique
Décrire les conditions nécessaires à l’utilisation des trois méthodes de coupe (sectionnement) des tissus
1) Cryostat :
- Tissu congelé
- Sections minces (10 à 50 um)
2) Microtome :
- Tissu congelé ou non
- Enveloppé dans paraffine, OCT, plastique
- Sections moyennes (25 à 100 um)
3) Vibratome : lame vibrante
- Tissu non congelé
- Sections épaisses (100 à 400 um)
Schématiser les trois point de vue de coupes
Voir diapo 16
Nommer et décrire (nature, ce qu’ils marquent, avantages/inconvénients, selon colorant) les colorants vus en classe
1) Cresyl violet : teinture basophile pour coloration Nissl
- Marque molécules acides (ADN, ARN), donc marquent le soma des neurones
2) DAPI : colorant fluorescent
- Marque noyaux par intercalation entre spirales ADN,, donc marquent soma neurones
3) Weil : colorant des fibres
- Marque myéline, donc les axones des neurones
ATTENTION : impossible identifier fibres individuelles
4) De Golgi :
- Marque complètement neurones individuels et leurs ramifications (axones non myélinisés slm)
- Marque slm 10 à 15% cellules totales
- Peut pas contrôler neurones marqués
Nommer et décrire les marqueurs vus en classe
1) Fluorescent
Ex. Génétiques (GFP - Green Fluo Protein), et fluorophores (Alexa488, Rhodamine, etc.)
2) Quantum dots : nanocristaux semi-conducteurs, résistant au blanchiment photonique, émettent couleur spécifique à partir faisceau lumineux selon leur taille
3) Sondes génétiques : ADN
4) Chromogénique : réaction enzymatique avec substrat produisant composé coloré
Ex. HRP (Horseradish peroxydase), B-galactosidase/X-Gal, Biotin/avidin (activé par courant électrique, comme neurones!)
5) Radioactif : réaction directe, marquage 1:1, localisation récepteurs, prolifération, trafic protéique
6) Or : dense aux électrons pour micro électronique
Décrire (objectif, prérequis, etc.) la méthode d’hybridation in-situ
Sert à visualiser ADN et ARN spécifiques, pour déterminer quand et ou un gène est exprimé, impossible de savoir ou protéine est par contre.
Faut connaître séquence de l’ARNm, faire sonde d’ADN simple brin complémentaire, marquer sonde pour détection (nucléo. colorés, fluos, radioactifs, etc.), puis mettre sonde en contact avec tissu pour hybridation
Quel genre de contrôles peut-on faire pour s’assurer de la viabilité d’une hybridation in-situ?
- Sonde non complémentaire du sens de la séquence cible,
- Autres sondes différentes pour régions différentes du même transcrit
- FISH (hybridation in-situ fluorescente) simultané
Vrai/Faux : hybridation in-situ marque ADN, et immunochimie marque protéines et autres biomolécules
Vrai
Comparer immucyto/histochimie/fluorescence
TOUTES EFFECTUÉES PAR ANTICORPS
Cyto : pour les cellules
Histo : pour des coupes histologiques de tissus
Fluorescente : avec détection fluo
Quelle est la différence entre un anticorps poly et monoclonal
Monoclonal ne reconnaît qu’un épitope d’antigène, poly peut en reconnaitre plusieurs
Comparer la détection directe et indirecte en immunohistochimie
Directe : liaison anticorps primaire marqué et cible directement
Indirecte : liaison anticorps secondaires marqués et anticorps primaire sur cible, il peut y avoir amplification lorsque plus qu’un anticorps secondaire peut reconnaitre primaire
Quels sont les contrôles utilisés en immunochimie?
Positifs :
- Spécimen CONFIRMÉ ayant antigène
Négatifs :
- Spécimen CONFIRMÉ ayant pas antigène
- Pré-incubation anticorps avec antigène pour savoir s’il fonctionne
- IHC indirecte : spécimen incubé sans anticorps primaire pour voir si secondaire se lie directement
Qu’est-ce qu’un gène rapporteur? Pourquoi les utiliser au lieu des anticorps?
Gène NON-ENDOGÈNE exprimé et contrôlé par un promoteur, qui code pour une molécule observable qui sert de marqueur (ex. GFP)
Permettent examiner expression temporelle et spatiale d’un gène en mesurant expression rapporteur
Expliquer le principe de photoactivation
Rapporteur devient fluo après excitation avec un laser (lumière), très spatialement sélectif.
Définir généralement les traceurs, et comparer les antérogrades vs rétrogrades
Sondes chimiques ou génétiques fluo ou chromogéniques (colorées) qui marquent voies axonales pour mettre en évidence la connectivité d’un système nerveux
Antérograde : du corps cellulaire à la terminaison synaptique
- Montrent projections efférentes, donc régions colorées reçoivent afférences de site d’injection (pcq se déplace vers terminaisons synaptiques)
Rétrograde : de la terminaison synaptique au corps cellulaire
- Montrent projections afférentes, donc régions colorées projettent vers site d’injection (pcq se déplace vers corps cellulaire et dendrites)
Qu’est-ce qu’un traceur trans-synaptique?
Qui peut traverser synapses et marquer plusieurs neurones d’un circuit
Quels sont les avantages et inconvénients des traceurs viraux?
Avantage :
- Auto-amplification (se réplique lui-même dans les corps cellulaires neuronaux)
Désavantages :
- Peut tuer neurones
- Infection peut se généraliser chez animaux
- Plus infection dure longtemps, plus marquage est beau, mais peut tuer neurones primaires et secondaires à cause du stress.
Donner et décrire brièvement les exemples vus en classe de traceurs communs
- Microsphères fluos : rétrogrades
- Sous-unité B de la toxine du choléra (CTB) : rétrograde, mais peut aussi être antérograde
- Acides aminés radioactifs : trans-synaptiques antérograde, détectés par l’autoradiographie
- Virus pseudorabies et herpès simples : trans-synaptiques
Vrai/Faux : un traceur antérograde trans-synaptique injecté dans la moelle épinière y restera
Faux, il sera retrouvé dans les muscles, vu qu’il peut se diffuser à travers synapses jusqu’à cible.
