Cours 6 - Visualisation de structures du système nerveux (complet)

Question 1

Nommer les 4 étapes de préparation des tissus neuraux

Answer 1

1) Fixation
2) Dissection
3) Enveloppement
4) Sectionnement

Question 2

Définir le processus de fixation, et pourquoi il est nécessaire

Answer 2

Utilisation de produits chimiques pour préserver, stabiliser et renforcer échantillon pour analyses micro

• Renforcer interaction moléculaires
• Désactiver enzymes protéolytiques
• Éliminer microorganismes de dégradation

Question 3

Nommer les deux agents et modes de fixation

Answer 3

Agents :

1) Cross-linking : formation liaisons covalentes
- Avec aldéhydes (micro photonique)
- Avec terroxide d’osmium (micro électronique)

2) Déshydratation : perturbation lipides, réduction solubilité protéines (méthanol, acétone)

Modes :

1) Immersion : temps varie selon taille/épaisseur tissu
2) Perfusion transcardiaque : pénétration ventricule gauche sous anesthésie

Question 4

Comment est-ce que l’eau peut endommager tissus lors de la congélation? Et que fait-on pour y remédier?

Answer 4

Lorsqu’elle gèle, eau forme des cristaux qui peuvent couper tissus.

On submerge dans solution de 30% sucrose

Question 5

Définir l’étape d’enveloppement, et les milieu utilisés

Answer 5

On met le tissu dans une enveloppe pour stabiliser la structure du tissu, et faciliter les coupes

• OCT compound (Optimal Cutting Temperature)
• Gélatine
• Paraffine
• Plastique

Question 6

Décrire les conditions nécessaires à l’utilisation des trois méthodes de coupe (sectionnement) des tissus

Answer 6

1) Cryostat :
- Tissu congelé
- Sections minces (10 à 50 um)

2) Microtome :
- Tissu congelé ou non
- Enveloppé dans paraffine, OCT, plastique
- Sections moyennes (25 à 100 um)

3) Vibratome : lame vibrante
- Tissu non congelé
- Sections épaisses (100 à 400 um)

Question 7

Schématiser les trois point de vue de coupes

Answer 7

Voir diapo 16

Question 8

Nommer et décrire (nature, ce qu’ils marquent, avantages/inconvénients, selon colorant) les colorants vus en classe

Answer 8

1) Cresyl violet : teinture basophile pour coloration Nissl
- Marque molécules acides (ADN, ARN), donc marquent le soma des neurones

2) DAPI : colorant fluorescent
- Marque noyaux par intercalation entre spirales ADN,, donc marquent soma neurones

3) Weil : colorant des fibres
- Marque myéline, donc les axones des neurones
ATTENTION : impossible identifier fibres individuelles

4) De Golgi :
- Marque complètement neurones individuels et leurs ramifications (axones non myélinisés slm)
- Marque slm 10 à 15% cellules totales
- Peut pas contrôler neurones marqués

Question 9

Nommer et décrire les marqueurs vus en classe

Answer 9

1) Fluorescent
Ex. Génétiques (GFP - Green Fluo Protein), et fluorophores (Alexa488, Rhodamine, etc.)

2) Quantum dots : nanocristaux semi-conducteurs, résistant au blanchiment photonique, émettent couleur spécifique à partir faisceau lumineux selon leur taille
3) Sondes génétiques : ADN

4) Chromogénique : réaction enzymatique avec substrat produisant composé coloré
Ex. HRP (Horseradish peroxydase), B-galactosidase/X-Gal, Biotin/avidin (activé par courant électrique, comme neurones!)

5) Radioactif : réaction directe, marquage 1:1, localisation récepteurs, prolifération, trafic protéique
6) Or : dense aux électrons pour micro électronique

Question 10

Décrire (objectif, prérequis, etc.) la méthode d’hybridation in-situ

Answer 10

Sert à visualiser ADN et ARN spécifiques, pour déterminer quand et ou un gène est exprimé, impossible de savoir ou protéine est par contre.

Faut connaître séquence de l’ARNm, faire sonde d’ADN simple brin complémentaire, marquer sonde pour détection (nucléo. colorés, fluos, radioactifs, etc.), puis mettre sonde en contact avec tissu pour hybridation

Question 11

Quel genre de contrôles peut-on faire pour s’assurer de la viabilité d’une hybridation in-situ?

Answer 11

• Sonde non complémentaire du sens de la séquence cible,
• Autres sondes différentes pour régions différentes du même transcrit
• FISH (hybridation in-situ fluorescente) simultané

Question 12

Vrai/Faux : hybridation in-situ marque ADN, et immunochimie marque protéines et autres biomolécules

Answer 12

Vrai

Question 13

Comparer immucyto/histochimie/fluorescence

Answer 13

TOUTES EFFECTUÉES PAR ANTICORPS

Cyto : pour les cellules

Histo : pour des coupes histologiques de tissus

Fluorescente : avec détection fluo

Question 14

Quelle est la différence entre un anticorps poly et monoclonal

Answer 14

Monoclonal ne reconnaît qu’un épitope d’antigène, poly peut en reconnaitre plusieurs

Question 15

Comparer la détection directe et indirecte en immunohistochimie

Answer 15

Directe : liaison anticorps primaire marqué et cible directement

Indirecte : liaison anticorps secondaires marqués et anticorps primaire sur cible, il peut y avoir amplification lorsque plus qu’un anticorps secondaire peut reconnaitre primaire

Question 16

Quels sont les contrôles utilisés en immunochimie?

Answer 16

Positifs :
- Spécimen CONFIRMÉ ayant antigène

Négatifs :

• Spécimen CONFIRMÉ ayant pas antigène
• Pré-incubation anticorps avec antigène pour savoir s’il fonctionne
• IHC indirecte : spécimen incubé sans anticorps primaire pour voir si secondaire se lie directement

Question 17

Qu’est-ce qu’un gène rapporteur? Pourquoi les utiliser au lieu des anticorps?

Answer 17

Gène NON-ENDOGÈNE exprimé et contrôlé par un promoteur, qui code pour une molécule observable qui sert de marqueur (ex. GFP)

Permettent examiner expression temporelle et spatiale d’un gène en mesurant expression rapporteur

Question 18

Expliquer le principe de photoactivation

Answer 18

Rapporteur devient fluo après excitation avec un laser (lumière), très spatialement sélectif.

Question 19

Définir généralement les traceurs, et comparer les antérogrades vs rétrogrades

Answer 19

Sondes chimiques ou génétiques fluo ou chromogéniques (colorées) qui marquent voies axonales pour mettre en évidence la connectivité d’un système nerveux

Antérograde : du corps cellulaire à la terminaison synaptique
- Montrent projections efférentes, donc régions colorées reçoivent afférences de site d’injection (pcq se déplace vers terminaisons synaptiques)

Rétrograde : de la terminaison synaptique au corps cellulaire
- Montrent projections afférentes, donc régions colorées projettent vers site d’injection (pcq se déplace vers corps cellulaire et dendrites)

Question 20

Qu’est-ce qu’un traceur trans-synaptique?

Answer 20

Qui peut traverser synapses et marquer plusieurs neurones d’un circuit

Question 21

Quels sont les avantages et inconvénients des traceurs viraux?

Answer 21

Avantage :
- Auto-amplification (se réplique lui-même dans les corps cellulaires neuronaux)

Désavantages :

• Peut tuer neurones
• Infection peut se généraliser chez animaux
• Plus infection dure longtemps, plus marquage est beau, mais peut tuer neurones primaires et secondaires à cause du stress.

Question 22

Donner et décrire brièvement les exemples vus en classe de traceurs communs

Answer 22

• Microsphères fluos : rétrogrades
• Sous-unité B de la toxine du choléra (CTB) : rétrograde, mais peut aussi être antérograde
• Acides aminés radioactifs : trans-synaptiques antérograde, détectés par l’autoradiographie
• Virus pseudorabies et herpès simples : trans-synaptiques

Question 23

Vrai/Faux : un traceur antérograde trans-synaptique injecté dans la moelle épinière y restera

Answer 23

Faux, il sera retrouvé dans les muscles, vu qu’il peut se diffuser à travers synapses jusqu’à cible.