Cours 4 - Électrophysiologie (complet) Flashcards
Définir électrophysiologie
Domaine d’exploration de l’activité électrique des neurones vivants et des processus moléculaires et cellulaires qui régissent leur signalisation.
À combien est le potentiel de repos neuronal?
Entre -60 et -70 mV
Vrai/Faux : canaux sodiques ne participent pas au maintient du potentiel de repos
Vrai
Définir potentiel d’équilibre pour un ion, et donner les valeurs du potentiel d’équilibre du K+, Na+ et Cl-
Potentiel auquel entrée et sortie ionique est égale pour un ion donné.
K+ = -75 mV Na+ = +55 mV Cl- = -60 mV
Différencier PPSE et PPSI
PPSE : Potentiel Post-synaptique Excitateur, généralement médié par le glutamate, cause dépolarisation
PPSI : Potentiel Post-synaptique Inhibiteur, cause hyperpolarisation
Pourquoi est-ce que les potentiels d’actions partent slm du cône d’activation?
Pcq grande densité de canaux Na+ voltage-dépendants, donc moins haut seuil de déclenchement.
Expliquer le mécanisme du potentiel d’action à l’aide du graphique de la diapo 68
Voir diapo 11
Décrire les 11 éléments essentiels d’un poste d’électrophysiologie, schématiser si nécessaire
1) Perfusion : avec solution d’électrolytes pour garder neurones enregistrés en vie
Ex. ACSF (Artificial CerebroSpinal Fluid)
2) Microélectrode d’enregistrement et/ou électrode de stimulation : en verre, remplie de la solution d’électrolytes pour enregistrer (d’enregistrement) ou appliquer un courant électrique (de stimulation)
3) Étireur : fabrique microélectrode en étirant tubes de verre
4) Préamplificateur : premier niveau détection signal, transmet vers amplificateur et vers électrode de référence
5) Microdrive : positionne électrode dans tissu, contrôlé par micromanipulateur pour mouvements précis
6) Micromanipulateur : contrôle microdrive, permet positionnement précis microélectrode grâce à mouvements fins (ex. 0,1 um) sur les axes X, Y et Z.
7) Amplificateur : amplifie signal du préampli, exécute aussi changements imposés par expérimentateur
8) Interface analogue-digital : digitalise le signal analogue de l’amplificateur pour qu’il soit compatible avec un ordinateur
9) Stimulation isolation unit : réduit le bruit électrique lié à une prise régulière en générant le pulse via une batterie qu’il transmet à l’électrode de stimulation
10) Cage de Faraday : isole poste contre bruit électrique de l’extérieur
11) Table anti-vibration : contre les effets de vibration de la table sur le positionnement de l’électrode
Voir diapo 12
Nommer et décrire brièvement les trois types d’enregistrements in vitro
1) Expression hétérologue : expression d’une protéine cible dans un autre système que celui d’origine
2) Cellules primaires isolées : culture de neurones dissociés à partir d’une région d’intérêt
3) Tranches de cerveau : cultures de coupes de tissu entier
Donner avantages/désavantages de l’enregistrement in vitro des cellules primaires isolées
Avantages :
- Possibilité d’étudier protéine exprimée de manière endogène (ex. un canal ionique)
Désavantages :
- Cellules forment connexions synaptiques en culture, pas représentatif connexions neuronales normales dans circuit
Donner avantages/désavantages de l’enregistrement in vitro des tranches de cerveau
Avantages :
- Enregistrements intracellulaires plus facile que in-vivo (le tissu ne bouge pas!)
- Étudier rôle neurones dans circuit
- Cultures à long terme permettent l’expression de protéines ectopiques (via virus, canon à gènes, etc.)
Désavantages :
- Visibilité pire qu’avec des cultures isolées primaires
- Substances pharmacologiques ajoutés au bain doivent pénétrer dans le tissu
- Connectivité synaptique pourrait changer dans les cultures à long terme (comme cellules primaires isolées)
Nommer les trois types de techniques d’électrophysiologie
1) Enregistrement extracellulaire
2) Enregistrement intracellulaire
3) Patch-clamp
Que mesure spécifiquement la technique d’enregistrement extracellulaire?
Différences de potentiels sur la surface extérieure d’un neurone actif.
Donner avantages/désavantages de la technique d’enregistrement extracellulaire
Avantage :
- Facile à faire
Désavantage :
- Impossible mesurer évènements sous le seuil d’une seule cellule
Expliquer le phénomène de potentiels de champ locaux
En plus du potentiel présynaptique, on détecte le potentiel postsynaptique qui découle de l’ouverture des récepteurs au sodium ligand-dépendants.
Que mesure spécifiquement la technique d’enregistrement intracellulaire?
Petits changements du potentiel de membrane local causés par évènements synaptiques
Donner avantages/désavantages de la technique d’enregistrement intracellulaire
Avantage :
- Échange minimal entre solution de la pipette et le cytoplasme
Désavantages :
- Difficile à réaliser avec petits neurones
- Enregistrement en voltage imposé impossible (on a besoin de deux électrodes)
Décrire généralement la technique d’enregistrement en patch-clamp, et nommer toutes les configurations
Micropipette touche membrane plasmique neuronale, légère succion à l’intérieur de micropipette forme un joint étanche entre les deux (giga-ohm-seal), ce qui isole morceau de membrane sous la pipette du reste de la membrane
Configurations :
- Pipette attachée à la cellule (« cell attached configuration »)
- Cellule entière (« whole-cell configuration »)
- Extérieur-extérieur (« outside-out configuration »)
- Intérieur-extérieur (« inside-out configuration »)
- Patch perforé
Expliquer la configuration patch-clamp en patch perforé
Solution de la pipette contient un produit chimique qui provoque de petites perforations dans la membrane. Cela permet petite conductance ionique mais pas de fuite du cytoplasme.
Voir diapo 46 pour schéma
Donner avantages/désavantages de la configuration patch-clamp en patch perforé
Avantages :
- Possibilité d’enregistrer un canal ionique isolé
- Excellent contrôle des milieux intra et extracellulaires
Désavantage :
- Risque de changer propriétés du canal à cause de l’altération de l’environnement cellulaire
Expliquer la configuration patch-clamp en extérieur-extérieur
Milieu intracellulaire est l’intérieur de pipette ; extracellulaire, le bain. Changer rapidement propriétés (concentrations ioniques entre autres) milieu extracellulaire (pcq peut changer la solution dans le bain rapidement).
Expliquer la configuration patch-clamp en intérieur-extérieur
Milieu extracellulaire est l’intérieur de pipette ; intracellulaire, le bain. Changer rapidement propriétés du milieu intracellulaire.
Donner avantages/désavantages de la configuration patch-clamp en pipette attachée à cellule
Avantages :
- Facile
- Milieu intracellulaire intact
- Possibilité d’enregistrer un canal ionique isolé
Désavantages :
- Contrôle pas milieu intracellulaire
- Valeur potentiel membranaire inconnue
Donner avantages/désavantages de la configuration patch-clamp en cellule entière
Avantages :
- Enregistrements en voltage imposé (grand contrôle du potentiel membranaire vu grande ouverture de pipette)
- Contrôle du milieu intracellulaire via échanges cytoplasme-solution
Désavantage :
- Perte de constituants intracellulaires via échanges cytoplasme-solution
Décrire la procédure pas-à-pas de l’enregistrement en patch-clamp
1) Remplir pipette avec solution intracellulaire (ex. ACSF)
2) Perfuser chambre d’enregistrement
3) Mettre tranche dans chambre
4) Placer électrodes de stimulation
5) Placer la pipette d’enregistrement dans ACSF dans chambre
6) Appliquer pression positive (vérifier si bulles d’air obstruent pointe)
7) Mettre voltage imposé à 0 mV
8) Approcher tissu et positionner électrode à côté neurone
9) Approcher membrane doucement et vérifier formation d’une fossette
10) Relâcher pression et appliquer succion
11) Vérifier joint giga-Ohm
12) Vérifier validité des paramètres sur programme de l’ordinateur
13) Observer ratio Rm vs Ra
14) Effectuer les enregistrements!
Comparer Rm et Ra dans l’enregistrement patch clamp
Ra = résistance au point d’accès (entre la membrane et la pipette)
Rm = résistance membranaire du neurone complet
Rm doit être au moins 10 fois plus grande que Ra, sinon fuite du cytoplasme localement et invalidation des mesures
