Cours 11 - Manip gènes endogènes (complet)

Question 1

OBJECTIFS

Answer 1

• Nommer et décrire méthodes génétiques de sélection de pop. neuronales ou de perte/gain de gène d’intérêt
• Avantages et inconvénients des méthodes abordées
• Élaborer stratégie méthodologique pour aborder question scientifique

Question 2

Nommer les deux méthodes de marquage de pop neuronales spécifiques

Answer 2

1) Transgènes

2) Knock-in

Question 3

Expliquer généralement le transgène et le knock-in

Answer 3

Transgène : permet d’exprimer une construction génique exogène avec un vecteur, s’intègre pas à un endroit spécifique dans génome, il s’intègre n’importe ou, ou ne s’intègre pas du tout.

Knock-in : utilise promoteur endogène du génome d’un animal, mais on remplace le gène qui suit, pour qu’il soit produit par l’animal

Question 4

Quelle sélectivité permet le choix judicieux de promoteur?

Answer 4

Spatiale (entre autres) : les promoteurs peuvent être ubiquitaires (exprimés partout) ou spécifiques à une pop. cell. donc peuvent permettre une sélectivité spatiale d’expression

Question 5

Donner un exemple de promoteur ubiquitaire

Answer 5

TRE, qui permet aussi un contrôle temporel

Question 6

Expliquer les étapes générales du clonage de transgène

Answer 6

1) Sélection d’un plasmide exprimant promoteur voulu
2) Sélection 2e plasmide contenant cassette d’expression désirée (gène voulu)
3) Digestion des plasmides par enzymes de restriction pour libérer les morceaux nécessaires (promoteur du plasmide 1 et gène du plasmide 2)
4) Insérer plasmide 1 en amont de cassette d’expression du plasmide 2

Question 7

Donner les 5 étapes de création d’une souris transgénique

Answer 7

1) Construction du transgène (sélection promoteur, clonage ADNc choisi, purification d’ADN)
2) Microinjection de l’ADN dans les embryons
3) Conservation pendant transfert ADN
4) Transfert des embryons dans femelles en gestation
5) Identification des bébés porteurs (fondateurs)

Question 8

Comment identifier des souris porteurs d’un transgène?

Answer 8

On injecte sonde pour transgène et on compare avec Southern blot

Question 9

Qu’est-ce qu’on veut dire par “effet positionnel” d’un transgène?

Answer 9

La position d’insertion d’un transgène, peut se mettre n’importe où dans l’ADN. Donc un même transgène, avec même promoteur, mais inséré dans deux individus différents peut atteindre populations cell. différentes

Question 10

Vrai/Faux : lors d’un knock-in, le gène endogène remplacé par la construction deviendra non-fonctionnel, donc l’animal n’aura aucune copie fonctionnelle

Answer 10

Faux, il restera une copie fonctionnelle à l’animal, mais cela peut quand même causer des modifs physio ou comportementales potentiellement dangereuses pour l’animal

Question 11

À quoi servent les cassettes de sélections? Donner deux exemples

Answer 11

S’assurer que le knock-in s’est bien déroulé. Peut être positive (ex. intégration protège contre un antibiotique ou permet survie) ou négative (ex. intégration tue cell.)

Ex.

• TK : si intégré, cell meure
• Néo : si intégré, cell survit

Question 12

Donner les étapes de prod d’un knock-in

Answer 12

1) Prod de l’allèle recombinant
2) Microinjection dans cellules souches (sélection subséquente)
3) Insertion cell souches dans blastocyste
4) Transfert du blastocyste à mère porteuse
5) Croisements successifs des bébés pour obtention d’un knock-in uniforme (vu que insertion dans blastocyste crée mosaïque vu que une seule des cell est modifiée)

Question 13

Vrai/Faux : comme pour les transgènes, on vérifie l’intégration du knock-in dans le génome par Southern blot

Answer 13

Vrai

Question 14

Vrai/Faux : il n’y a pas d’effet positionnel pour un knock-in, cela leur intégration moins fiable que celle des transgènes

Answer 14

Faux, il n’y a pas d’effet positionnel pour un knock-in, mais cela les rends plus fiables

Question 15

Décrire les trois molécules de marquage sélectif

Answer 15

1) LacZ : coloration stable à la lumière
2) EGFP : marquage en immunofluo
3) Cre : recombinase à jumeler avec allèle rapporteur

Question 16

Décrire le marquage à l’aide de Cre-LoxP

Answer 16

Cre est recombinase qui coupe portion STOP entre deux séquences LoxP, permet d’exprimer un EGFP fluo.

Il faut croiser une souris portant Cre, et une portant EGFP pour avoir un descendant exprimant les deux.

Permet de suivre l’évolution d’un type cell.

Question 17

Que permet la méthode Cre-ER qui est impossible avec Cre-LoxP? Comment?

Answer 17

Contrôle d’expression temporelle.

Cre-ER n’est exprimé qu’à partir du moment (quelques heures après) ou on donne du Tamoxifène

Question 18

Nommer les 3 méthodes de perte de fonction de gènes

Answer 18

1) Délétions de gènes endogènes (knock-out)
2) Mutations ciblées
3) Répression de l’expression (avec ARN)

Question 19

Vrai/Faux : on ne peut pas faire un kock-out sélectif à une sous-population cell

Answer 19

Vrai, sauf en combinaison avec autres méthodes comme Cre

Question 20

Par quel mécanisme se fait l’ablation sélective de Sox6? Et dans quel but?

Answer 20

On utilise Cre-LoxP. Cre va couper Sox6 en même temps que LoxP autours de EGFP, mais seulement dans certaines cell, ce qui permet une sélectivité spatiale pour les interneurones, et produit des souris viables.

Question 21

Décrire la méthode CRISPR-Cas9

Answer 21

Modif directe du génome. Peut faire knock-in ou out. Cas-9 est endonucléase qui cause des coupures du double brin d’ADN. Voie de réparation détermine si knock-in ou out.

• NHEJ ; cause un knock-out, est la voie favorisée naturellement
• HR ; cause knock-in, nécessite produits pour être favorisée

Question 22

Nommer les 3 utilisations de la mutagénèse par CRISPR-Cas9

Answer 22

1) Générer knock-out
2) Générer knock-in
3) Corrections de défauts génétiques

Question 23

Qu’est-ce qu’un knock-down?

Answer 23

Dégradation d’ARNm avant traduction en protéine. Peut se faire par le biais de siARNs, ou par shARN exprimé par un transgène sous contrôle d’un promoteur spécifique

Question 24

À quoi sert un gain de fonction avec un transgène (ou sauvetage/”rescue”)

Answer 24

Comparer l’action de deux molécules dans une cascade pour voir quelle vient en premier

Question 25

Expliquer la méthode d’expression temporelle d’un transgène TetO

Answer 25

On utilise un promoteur pouvant être induit (Tet-ON) ou inhibé (Tet-OFF) par la doxycycline pour contrôler à quel moment le transgène est exprimé, ou cesse de l’être.

Question 26

Comparer (avantages/inconvénients) les méthodes : transgène (promoteur spécifique), Tet-ON/OFF, knock-in, knock-out, knock-out conditionnel, knock-down et CRISPR-Cas9

Answer 26

Voir diapos 37 et 38

Question 27

Caractériser les 3 méthodes de transfert de plasmides

Answer 27

1) Électroporation “in utero” : injection intra-ventriculaire d’un plasmide, puis application d’une série de décharge pour créer pores dans cell perméables à ADN. ADN ne s’intègre pas au génome, et sera transcrit de façon soutenue selon le promoteur
2) Transfection biolistique : ADN couplé sur billes d’or qui sont projetées à haute vitesse sur cell cibles. Une seule cell incorpore ADN à la fois, donc crée mosaïque
3) Vecteurs viraux : insertion d’un vecteur viral portant le plasmide voulu dans la cell qui commence à exprimer le transgène

Question 28

Comparer (avantages/inconvénients) les méthodes : transgénèse, électroporation in utero/vitro, transfection biolistique, vecteurs viraux AAV et lentivirus.

Answer 28

Voir diapos 45 et 46