Cours 7 Flashcards by Melissa Villarreal

Est-ce qu’il y a une origine de réplication retrouvés dans les c de mammifères?

Non

—> ADN introduit dans les c mammifères va être dilué au fil du temps avec la division cellulaire

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Comment augmenter la durée de vie de l’ADN plasmide que dans les c eukaryotes?

Inclure séquence d’ADN SV40 dans le vecteur

—> réplication d’un virus eukaryote

—> fait protéine SV40LT qui se lié au promoteur SV40 : origine de réplication

augmente qte de plasmide dans les c des mammiferes

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Promoteur pour les plasmides dans les c mammifères

Promoteur CMV
—> constitutivement actif

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Pourquoi ajouter une queue poly A ?

Stabiliser l’ARNm pour qu’il puisse faire la traduction en protéines

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Comment s’appelle l’introduction d’un vecteur dans une c prokaryote et eukaryote?

Prokaryote : transformation

Eukaryote: transfection

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façons d’introduire un vecteur dans une c?

1) virus (transduction)

2) contact entre b —> conjugaison

3) réactifs chimiques

4) electroporation

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Transfection transitoire

Dure quelques jours

—> plasmide atteint le noyau et permet l’expression de protéines

plasmide est progressivement dilué lors de la mitose ou dégradé

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Transfection stable

phénomène cellulaire rare qui est positivement sélectionné par l’ajout d’un l’antibiotique de sélection

Après plusieurs jours de sélection, les cellules n’ayant pas intégré le gène de résistance meurent

—> insertion aléatoire (faible efficacité)

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Efficacité de la transfection

pourcentage de cellules qui ont absorbé l’ADN

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Quand est-ce qu’on utilise la sélection par antibiotique dans la transfection?

—> dans la transfection stable

transitoire – pas d’antibiotique

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Transfection par le phosphate de calcium

formation d’un précipité —> mélange lentement une solution phosphate tamponée et une solution de chlorure de calcium (CaCl2) contenant l’ADN.

• Efficacité de transfection de 50- 100% sur certaines lignées.

• Le précipité adhère ensuite aux cellules et pénètre par endocytose.

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Transfection par l’utilisation de polycation:
polyethyleneimide (PEI)

1) formation d’agrégat soluble d’ADN avec charge +
—> s’associe à la membrane cellulaire (-)

2) endocytose
—> ADN entre dans noyau

—> ajout d’hydrophobicité

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Transfection par agents cationiques lipidiques

Lipide (+) encapsule l’ADN —> interagit avec mem. Cellulaire (-)

—> endocytose

ADN libéré entre dans le noyau

• endosome peut être transformé en lysosome et ADN sera dégradé

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Transfection par électroporation

pulsations électriques (millisecondes) génèrent des trous dans la membrane cellulaire, permettant ainsi à l’ADN de pénétrer la cellule

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Nucleofection

—> combinaison de produits chimiques et electroporation

Électroporation de l’ADN dans le noyau et cytoplasme

Efficace même sur des cellules qui ne se divisent pas

•Expression protéique très rapide

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Comment est-ce que l’ADN introduit dans le cytoplasme entre dans le noyau?

Lors de la division cellulaire —> bris de la membrane nucléaire

Méthode pour évaluer l’efficacité de la transfection

Utiliser un marqueur fluorescent sur la protéine d’intérêt

—> possible de modifier pour que ce soit dans le noyau ou dans le cytoplasme

Que faire lorsque la transduction de cellules est faite par des virus?
Dans c humains/mammifères

Mesures de sécurité prises —> virus produits que dans des conditions très contrôlées

Transduction de cellules par des lentivirus codant pour la protéine recombinante

lentivirus —> retrovirus
Avantage: peut fonctionner dans c en division et pas en division

1) cellule d’emballage fabrique des virus avec le gène d’intérêt

2) virus infecte c d’intérêt par transduction
—> virus injecte ARN dans la c (+ facteurs pour transformer ARN en ADN)

3) souche c modifiée produit la protéine d’intérêt

Pourquoi est-ce que les virus produits ne peuvent pas s’autorepliquer?

Le génome ne code pas pour les autres composants protéiques essentiels (codés par des plasmides distincts)

—> 3 plasmides auraient besoin de se recombiner et être passés a une nouvelle c

Baculovirus

Permet la production de protéines dans les protéines des insectes

—> base sur un virus qui infecte et se réplique dans les c d’insectes (peut pas se répliquer dans les c de mammiferes)

—> n’a pas besoin des précautions requises pour les lentivirus

• besoin d’un plasmide donneur pFastBac , souche spéciale de E. Coli pour l’obtention de Bacmid (BAC: bacterial artificial chromosome)

• bacmid insère dans souche de E. coli (selection bleu/blanc) pour replication et l’ADN est ensuite inséré dans c insecte = stock de baculovirus

Bacmam

Adaptation du système baculovirus pour l’utilisation dans des c de mammiferes
• promoteurs mammiferes (pCMV)

—> infecte c de mammiferes mais ne peut pas se répliquer

Systeme + populaire pour l’édition du génome

CRISPR-Cas9
—> ADN coupé à un endroit spécifique déterminé par la séquence d’ARN

Réparation du bris CRISPR-Cas par quoi?

Par NHEJ - non homólogous end joining
—> mène souvent à inactivation du gene

HDR - homologous directed repair
—> fournit une matrice pour réparer la coupure : une séquence spécifique peut être introduite dans la séquence

Détection des protéines par Western Blot (ou immunobuvardage)

méthode rapide et sensible pour caractériser les protéines purifiées ou des mélanges complexes de protéines —> technique combine la résolution des gels d’éléctrophorèse et la spécificité de l’immunodétection par des anticorps monoclonaux et polyclonaux

Ac monoclonaux vs ac polyclonaux

Ac polyclonal: reconnaît plusieurs épitopes de la protéine Ac monoclonal: reconnaît un épitope de la protéine —> un Ag peut avoir plusieurs epitopes différents

Epitope definition & 2 types

—> séquence sur l’ag qui reconnaît le paratope sur l’Ac **Épitope linéaire** : tous les a.a. sont contigus dans la structure primaire - Composé de 4-6 résidus **Épitope conformationnel** : composé de séquences non contiguës mais rapprochées dans la structure tertiaire. - Plus complexes (jusqu’à 20 résidus)

Étape préalable au western blot

SDS-PAGE

Western blot étapes

0) séparation de protéines par SDS PAGE (protéines - par SDS) 1) immobiliser les protéines qui sont sur le gel sur une membrane nitrcellulose (Par electrophorese) 2) membrane couverte par protéine inerte (albumine) pour éviter liaison d’autres protéines 3) Ac pour la protéine d’intérêt ajouté 4) lavage : seulement Ac lié à la protéine reste attaché 5) Ac 2e ajouté qui interagit avec la Fc de l’Ac 1e —> extrémité Fc de l’Ac 2e est couplée à une enzyme permettant sa détection (Couleur sur membrane)

Détection des antigènes par colorimétrie

Approche courante pour détecter l’Ac 2e

Détection des antigènes par chimiluminescence Enzyme peroxydase horseradish (HRP) emet signal proportionnel à la qte de protéine quand couplé avec H2O2

Technique de Western blot est quantitative?

Semi-quantitative, pas rigoureuse

Détection des protéines par ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Immobilise la protéine d’intérêt sur un support solide —> immobilisation à l’aide d’un Ac (Ac de capture) ou complexe de Ni2+ pour fixer étiquette d’histidine sur la protéine • sites vides de la plaque bloqués • protéine détectée avec Ac de détection (Reconnaît protéine ou étiquette) • ajout d’enzyme qui se lie à l’Ac détecteur pour dévoiler la qte d’échantillon —> quantifier la qte fe protéine avec une courbe standard —> ELISA n’a pas de séparation par taille