Cours 3 Flashcards
4 outils de clonage
- Les vecteurs de clonage
- Les cellules hôtes
- Les enzymes pour manipuler l’ADN
- Les techniques reliées au clonage et à l’analyse
Site unique de démarrage de la réplication d’un plasmide
Ori
—> normalement riche en les nucleotides A et T
Marqueurs de sélection d’un plasmide fonction?
utilisés pour identifier et sélectionner les bactéries qui ont incorporé les vecteurs recombinants
—> Marqueurs de Sélection positive ou négative (Antibiotiques, LacZ)
Comment sont regroupés des sites de clonage dans un plasmide/vecteur
regroupés dans un
« polylinker » (ou site de clonage multiple/MCS)
4 étapes d’amplification d’un gène par vecteur
1) digestion-ligation
2) transformation, sélection, amplification
3) purification de l’ADN recombinant
4) analyse
Que font les enzymes de restriction
coupent l’ADN à des sites spécifiques constitués de séquences palindromiques sur les deux brins.
2 types d’enzymes de restriction
Endonucleases & exonucleases
Endo: hydrolysent une liaison ester interne
Exo: libèrent par hydrolyse le nucléotide situé à lʼextrémité 5ʼ ou 3ʼ
CRISPR-Cas utilise 2 types d’enzymes pour la protection contre les bacteriophages
Quels types?
• enzymes qui modifient l’ADN de la bactérie pour le protéger
• enzymes de restriction qui clivent l’ADN du phage
Nomenclature des enzymes de restriction
nommée en fonction de la bactérie à partir de laquelle elle a été isolée suivant un système basé sur
• le genre,
• l’espèce,
• la souche
• l’ordre d’identification dans cette bactérie
2 types d’extrémités générées par les enzymes de restriction
• COUPURES A BOUTS COHESIFS/COLLANTS
• COUPURES A BOUTS FRANCS
3 types de methylases dans la majorité des souches de E. Coli utilisée en laboratoire
Dam, Dcm et EcoK1
Que font les ADN méthylases
transfèrent des groupements methyl du S- adenosylmethionine à une adenine ou cytosine
—> méthylases des procaryotes sont associées aux systèmes de restriction/modification. Elles permettent de protéger l’ADN bactérien.
Que peut être une raison d’une enzyme de restriction qui ne clive pas?
—> methylation qui modifie des sites de restriction
(Si la méthylation est présente certaines enzymes de restriction ne clivent plus l’ADN)
—> Si une enzyme ne coupe pas il faut vérifier sa sensibilité à la méthylation et le cas échéant utiliser des bactéries déficientes dans les méthylases spécifiques pour produire cet ADN (comme dam-) .
3 formes de migration d’un plasmide sur gel d’agarose
Quelle est l’étape la plus problématique dans la procédure de clonage?
La ligation du fragment d’ADN d’intérêt au vecteur pour former le vecteur recombinant
Que fait l’ADN ligase?
Catalyselaformationdepontsphosphodiesterentre deux nucléotides dans l’ADN double brin
—> connecte le 3’OH au 5’phosphate avec ATP ou NAD+ comme cofacteur
3 étapes du mécanisme d’action de la T4 ADN ligase
1) adenylylation de l’ADN ligase
2) activation du côté 5’phosphate dans le bris
3) déplacement de l’AMP ferme le bris
Ligation de bouts collants avantage?
L’appariement des bases du bout collant favorise la ligation
Comment induire un clonage directionnel?
Via clonage avec des ADN à bouts collants avec enzymes différentes
—> memes enzymes pour l’insert et le vecteur (sauf dans le cas d’enzymes compatibles)
Est-ce qu’on peut faire une insertion directionnelle avec bouts francs?
Non
2 problèmes de faire des bouts francs?
1) Pas dʼappariement qui aide à la ligation
2) la probabilité que le vecteur se referme sur lui-même est plus grande que la probabilité d’incorporer l’insert
—> il faut mettre une C bcp plus grande d’insert que de vecteur
Comment inhiber la ligation du vecteur sur lui-même?
traitement CIP du vecteur, (pas de l’insert)
En enlevant le 5’phosphate on inhibe la ligation
—> utilisation de phosphatase (CIP, calf intestinal phosphatase)
Que font certaines polymerases aux extrémités 3’ des produits PCR?
Certaines polymérases possèdent une activité adenyl transférase qui ajoute des A aux extrémités 3’ des produits PCR
—> Hybridation T/A facilite ligation : mime bouts collants
Système pGEM fait quel type de clonage?
TA cloning
—> Hybridation T/A facilite ligation : mime bouts collants
—> vecteurs pGEM avec extrémités thymines (T) complémentaires aux extrémités adénine (A) de l’insert PCR
Système TOPO
ligation de produits PCR
Fragment d’ADN (insert) avec extrémités adénine (A)
Vecteur TOPO contient une topoisomerase I (enzyme qui peut couper un brin de l’ADNdb) —> clive un des brins du vecteur
forme des bouts T
—> permet le clonage directionnel
Caractéristiques de E. Coli
Bactérie gram -
Pas de membrane nucléaire
Chromosome : molécule duplexe circulaire avec 1 site d’attachement à la membrane et 1 origine de réplication unique
1e souche utilisée : K12
(Conservée comme souche pure)
Supporte réplication des plasmides
3 modifications de E. Coli K12 pour favoriser le clonage
1) Élimination des systèmes de restriction/modification
2) systèmes de recombinaison de l’ADN modifiés pour prévenir les réarrangement (RecA-)
3) activités endonucléases mutées pour augmenter le taux de production de plasmide (EndA-)
Transformation
Processus qui permet de faire entrer les vecteurs dans les bactéries
Efficacité de transformation
nombre de bactéries transformées par 1 microgramme dʼADN
Il faut faire quoi aux bactéries avant la transformation?
rendre les bactéries compétentes
—> Chimiquement compétentes (CaCl2 froid)/choc thermique (42 C)
—> Eléctrocompétentes (H2O froide)/éléctroporation
Préparation de bactéries chimiquement compétentes
(CaCl2 froid)/choc thermique (42 C)
Préparation de bactéries éléctrocompétentes
(H2O froide)/éléctroporation
Que permettent les antibiotiques lors du clonage
permettent de sélectionner les bactéries contenant le plasmide recombiné
- Ampicilline (1er gêne de résistance) - détecté vecteur
- 2e gêne de résistance - permet de différentier quelles bactéries ont l’insert recombiné
(Sélection négative / sélection positive)
Sélection négative par les antibiotiques
la bactérie contenant le plamide recombinant (avec insert) est prélevée sur la boite de milieu Amp par comparaison avec la boite de milieu Amp + Tet
2 formes de sélection positive (clonage)
- Sélection par antibiotique
- Sélection blanc/bleu
Système de sélection LacZ - blanc/bleu
LacZ alpha —> code pour le peptide alpha de la protéine beta-galactosidase
(Enzyme qui convertit X-Gal en produit bleu)
—> permet la complementation alpha
4 façons de Lyse membrane cellulaire – dénaturer l’ADN
- mécanique,
- détergent (SDS),
- lysozyme,
- lyse alcaline
Séparer l’ADN plasmidique des protéines et de l’ADN chromosomal
3 méthodes
- neutralisation pH (ségrégation par conformation)
- phenol extraction + ethanol precipitation
- silica-bead methods
