Cours 4 Flashcards

Question

Pourquoi est-ce que l’endonuclease de type IIs et l’enzyme ligase peuvent être ajoutés ensemble dans la méthode golden Gate?

Answer 1

Le produit de coupure par l’endonuclease ne contient plus le site de reconnaissance —> ne sera pas recoupé

Answer 2

1) PCR du vecteur et de l’insert pour introduire les séquences de reconnaissance BsaI (Nuc. À côté du site de reconnaissance choisis pour correspondre au gène d’intérêt) 2) ajout d’endonucease de type IIs (BsaI) et d’enzyme ligase au vecteur et gene d’intérêt TOUT ensemble

Answer 3

Si le vecteur receveur se referme, il aura à nouveau les sites de reconnaissance et seré recoupe pr BsaI —> vecteur avec insert d’intérêt ne contient pas les sites de reconnaissance

Answer 4

Que le produit final n’a pas les sites de restriction Ex, méthode Golden Gate

Answer 5

Car il crée de longues extrémités cohésives suffisamment stables pour être transformés sans ligature (coupures fixées dans la b E. Coli)

Answer 6

Polymerase Exonuclease 3’ —> 5’ —> produit des extensions de 10+ nucleotides

Answer 7

Séquence specifique incluse dans l’amorce de la réaction PCR —> pour l’insert Vecteur de clonage crée spécifiquement pour ce type de clonage avec une séquence de nucleotides spécifique pour le site de clonage —> clivage par BsaI (enlève site de reconnaissance) ou autre enzyme de restriction

Answer 8

1) digestion du plasmide avec BsaI ou SspI —> extensión de 4 nuc en 5’ 2) en absence des nuc nécessaires pour la polymérisation - la T4 adopte son activité exonuclease 3’ —> 5’ —> digestión seulement en présence de GTP Exonuclease va s’arrêter au premier C du brin matrice 3) insert amplifie pr PCR avec amorce complémentaire au plasmide, est coupé par BsaI ou SspI 4) insert subit activité exonuclease T4 3’—> 5’ avec seulement CTP —> va s’arrêter au premier G du brin matrice = longue région de complémentarité entre vecteur et insert

Answer 9

**technique indépendante de la sequence** —> arrêt d’exonuclease par temps, pas par présence d’un type de nuc comme dans LIC 1) PCR de l’insert avec ajout de séquences complémentaires au vecteur avec les amorces 2) Digestión de l’insert et du vecteur avec T4 Pol en absence de NTP = exonuclease 3’ —> 5’ 3) arrêt d’activité exonuclease arrête après un certain temps en ajoutant un seul NTP (ex dCTP) 4) vecteur et insert hybrides et transformés dans b —> taille d’extensions différentes = lacunes (Hybridation se fait à cause de la qte de nuc comolementaires ) Répares dans b

Answer 10

Avec PCR (Insert et vecteur) —> pas par enzymes de restriction

Answer 11

—> permet de cloner des séquences de n’importe quelle taille dans une seule réaction —> plusieurs fragments d’ADN peuvent être assemblés dans une seule réaction (6 segments d’ADN possibles) **regions de complémentarité** introduits dans le PCR dictent l’ordre des gènes assemblés

Answer 12

1) PCR de l’insert et du vecteur pour introduire regions complémentaires 2) ajout simultané de exonuclease (T5 : 5’ —> 3’) , polymerase (5’ —> 3’) et ligase (3 enzymes) —> joue avec T T5 exonuclease pas stable à 50C Phusion polymerase et Taq ligase stables à 50C

Answer 13

Ajout de séquence du vecteur à l’insert par amorces Ajout de séquence de l’insert qui vecteur par amorces

Answer 14

1) inactive exonuclease T5 après formation d’extrémités cohésives sb 2) inhibe formation de structure 2e dans région sb de l’ADN qui bloquerait l’hybridation avec le brin complémentaire

Answer 15

—> un même gêne d’intérêt peut être cloné dans plusieurs vecteurs avec la même stratégie 1e étape: cloner le gène d’intérêt dans un vecteur d’entrée Suite : transfert facile à n’importe quel vecteur Gateway

Answer 16

Création d’un vecteur d’entrée (plusieurs méthodes) Séquences spécifiques obligatoires autour le gène d’intérêt —> reconnues par BP clonase

Answer 17

Sur comment un phage intègre son ADN dans une bactérie

Answer 18

Coupe et recombine l’ADN avec des séquences spécifiques (C’est une Sérine Recombinase —> Sérine impliquée dans la coupure d’ADN)

Answer 19

INT (integrase) IHF (integrase host factor) —> supporte confirmation nécessaire pour faire la rotation —> attB et attP deviennent attL et attR

Answer 20

INT (integrase) IHF (integrase host factor) Xis (excisionase) —> supporte confirmation nécessaire pour faire la rotation de cette direction —> attL et attR deviennent attB et attP

Answer 21

un gène qui code pour une toxine de E. Coli (ccdB) —> bactéries avec le vecteur donneur va mourir à cause de la toxine acquérie du vecteur destination —> seulement les bactéries avec le vecteur d’expression vont survivre

Answer 22

Avoir 2 sortes de attL & attR Ou attB & attP (1 & 2) —> permet clonage directionnel

Answer 23

Mutation ciblée par PCR (Quikchange) Mutation ciblée par PCR (NEB)

Answer 24

Synthèse par PCR —> non méthylé

Answer 25

1 seule amorce pour substitution & insertion 2 amorces pour délétion