Cours 4 Flashcards
Ou est-ce que les endonucleases de type IIs coupent ?
Ex BsaI
Dehors leur séquence de reconnaissance
3 sites importants du vecteur-plasmide
1) marqueur de sélection - code pour la résistance à un antibiotique
2) origine de réplication - permet amplification et réplication du plasmide
3) polylinker, site de clonage - contient sites de restriction
—> où on va introduire l’insert
3 choses nécessaires pour le clonage par enzymes de restriction
1) enzymes des restriction
2) ADN ligase
3) produits de PCR
Qu’est-ce que le PCR ajouté au gene d’intérêt?
Des sites de restriction voulus de part et d’autre de l’insert
—> ajout avec des amorces contenant ces sites aux extrémités 5’
Pourquoi introduire des sites de restriction differents de chaque côté de l’insert?
Pour avoir un clonage unidirectionnel
Pourquoi est-ce qu’on digère l’insert avec des enzymes après PCR
Pour générer des extrémités cohésives
—> vecteur digéré avec memes enzymes pour générer des extrémités compatibles
Pourquoi est-ce que la direction de l’insért du vecteur est important?
Lorsqu’on veut exprimer qqch (ex. Une protéine) qui a le promoteur dans le vecteur
Produit de la PCR doit être purifié
Pourquoi?
Polymerase & nucleotides utilises en PCR
—> Pol: va remplir les extrémités cohésives lors de la digestion (extrémités cohésives)
—> vecteur doit être purifié aussi
Séquence complémentaire des amorces doit être environ combien de nuc?
20-30 nucleotides complémentaires
Pourquoi est-ce qu’on ajoute (~6nuc) supplémentaires au site de restriction via l’amorce? (PCR)
—> vont permettre l’enzyme EcoRI de couper
Enz de restriction ont besoin d’un certain # de nucleotides de chaque côté du site de restriction pour pouvoir s’attacher et couper efficacement
Comment est-ce qu’on purifie le vecteur digéré
En faisant migrer par gel d’agarose
—> coupe bandes d’intérêt du gel d’agarose, purifie ADN du gel
Codon de démarrage
ATG —> code pour methionine
Ça veut dire quoi respecter le cadre de la traduction lors du clonage
Clonage doit faire en sorte que les codons ne soient pas décalés —> changerait la séquence de la protéine
Comment respecter le cadre de la traduction lors du clonage?
Étudier les séquences du vecteur et de l’insert
—> stratégie simple : utiliser EcoRI (GAA TTC)
• fait en sorte que le cadre de traduction est respectée dans l’amorce
Quoi faire si le cadre de traduction est décalé?
Ex. salI
—> ajouter 1 ou 2 nuc additionels avant le ATG pour respecter le cadre de traduction
Pourquoi ne pas tjs choisir EcoRI si il marche toujours si bien?
Ex. Si il y a un site de restriction EcoRI dans l’insérât par hasard —> insert serait coupé pendant la digestion
Site de reconnaissance de Nde I particularité
Site de reconnaissance contient ATG et maintient le cadre de traduction
Du côté C terminal de la protéine
—> si on ne veut pas d’étiquette C terminale?
On n’a pas à se soucier du cadre de traduction après le codon stop pour l’insertion du site de restriction
Du côté C terminal de la protéine
—> si on veut conserver une ’étiquette C terminale?
Il faut se debarraser du codon stop qui précède l’étiquette
(Enlever la séquence TGA dans l’amorce)
Protéine est synthétisée comment? (Ordre)
N —> C
3 codons STOP
UAA, UAG, UGA
Quelle stratégie est possible pour cloner des ADN de petite taille ? (~200 nuc)
Commander 2 oligonucleotides parfaitement complémentaires sur toute la région d’intérêt - avec une phosphate 5’ de chaque côté
—> chaque oligo aura 2 extensions qui permettra le clonage dans le vecteur prédigéré avec les 2 enzymes de restriction
—> remplace étapes de digestion et purification
commander séquence qui demeurerait après la digestion
1e étape: hybrider les 2 oligonucleotides en chauffant dans un appareil de PCR & diminuant
2e étape: lier l’ADN db dans le vecteur digéré et purifié
Qu’est-ce qui est à chaque extrémité du gène d’intérêt avec la clonage avec enzymes de restriction?
Les sites du restriction sont autour du gène d’intérêt dans le plasmide recombinant
Clonage golden gate utilise quelles types d’endonucleases?
Elles marchent comment?
Endonucleases de type IIs
—> coupent à l’extérieur du site de reconnaissance
= produit final ne contient pas les sites de restriction
Pourquoi est-ce que l’endonuclease de type IIs et l’enzyme ligase peuvent être ajoutés ensemble dans la méthode golden Gate?
Le produit de coupure par l’endonuclease ne contient plus le site de reconnaissance —> ne sera pas recoupé
Étapes de méthode Golden Gate
1) PCR du vecteur et de l’insert pour introduire les séquences de reconnaissance BsaI
(Nuc. À côté du site de reconnaissance choisis pour correspondre au gène d’intérêt)
2) ajout d’endonucease de type IIs (BsaI) et d’enzyme ligase au vecteur et gene d’intérêt
TOUT ensemble
Qu’est-ce qui favorise la formation du vecteur avec l’insert dans Golden Gate?
Si le vecteur receveur se referme, il aura à nouveau les sites de reconnaissance et seré recoupe pr BsaI
—> vecteur avec insert d’intérêt ne contient pas les sites de reconnaissance
Ça veut dire quoi ne pas avoir des cicatrices de clonage?
Que le produit final n’a pas les sites de restriction
Ex, méthode Golden Gate
Pourquoi est-ce que la technique LIC (Ligation Independent Cloning) n’a pas besoin d’enzyme ligase?
Car il crée de longues extrémités cohésives suffisamment stables pour être transformés sans ligature
(coupures fixées dans la b E. Coli)
2 activités de l’ADN polymerase T4
Polymerase
Exonuclease 3’ —> 5’
—> produit des extensions de 10+ nucleotides
Vecteur de clonage et insert LIC prépare comment?
Séquence specifique incluse dans l’amorce de la réaction PCR —> pour l’insert
Vecteur de clonage crée spécifiquement pour ce type de clonage avec une séquence de nucleotides spécifique pour le site de clonage
—> clivage par BsaI (enlève site de reconnaissance) ou autre enzyme de restriction
Étapes LIC
1) digestion du plasmide avec BsaI ou SspI
—> extensión de 4 nuc en 5’
2) en absence des nuc nécessaires pour la polymérisation - la T4 adopte son activité exonuclease 3’ —> 5’
—> digestión seulement en présence de GTP
Exonuclease va s’arrêter au premier C du brin matrice
3) insert amplifie pr PCR avec amorce complémentaire au plasmide, est coupé par BsaI ou SspI
4) insert subit activité exonuclease T4 3’—> 5’ avec seulement CTP
—> va s’arrêter au premier G du brin matrice
= longue région de complémentarité entre vecteur et insert
SLIC étapes
technique indépendante de la sequence —> arrêt d’exonuclease par temps, pas par présence d’un type de nuc comme dans LIC
1) PCR de l’insert avec ajout de séquences complémentaires au vecteur avec les amorces
2) Digestión de l’insert et du vecteur avec T4 Pol en absence de NTP
= exonuclease 3’ —> 5’
3) arrêt d’activité exonuclease arrête après un certain temps en ajoutant un seul NTP (ex dCTP)
4) vecteur et insert hybrides et transformés dans b
—> taille d’extensions différentes = lacunes
(Hybridation se fait à cause de la qte de nuc comolementaires )
Répares dans b
Gibson assembly produit des régions complémentaires comment?
Avec PCR
(Insert et vecteur)
—> pas par enzymes de restriction
Gibson assembly avantage
—> permet de cloner des séquences de n’importe quelle taille dans une seule réaction
—> plusieurs fragments d’ADN peuvent être assemblés dans une seule réaction (6 segments d’ADN possibles)
regions de complémentarité introduits dans le PCR dictent l’ordre des gènes assemblés
Gibson assembly étapes
1) PCR de l’insert et du vecteur pour introduire regions complémentaires
2) ajout simultané de exonuclease (T5 : 5’ —> 3’) , polymerase (5’ —> 3’) et ligase (3 enzymes)
—> joue avec T
T5 exonuclease pas stable à 50C
Phusion polymerase et Taq ligase stables à 50C
Comment est-ce que la complémentarité est faite ne Gibson Assembly?
Ajout de séquence du vecteur à l’insert par amorces
Ajout de séquence de l’insert qui vecteur par amorces
2 utilites de monter la température à 50 C dans Gibson Assembly
1) inactive exonuclease T5 après formation d’extrémités cohésives sb
2) inhibe formation de structure 2e dans région sb de l’ADN qui bloquerait l’hybridation avec le brin complémentaire
Clonage de Gateway (Invitrogen) avantage
—> un même gêne d’intérêt peut être cloné dans plusieurs vecteurs avec la même stratégie
1e étape: cloner le gène d’intérêt dans un vecteur d’entrée
Suite : transfert facile à n’importe quel vecteur Gateway
Gateway cloning (Invitrogen) vecteur d’entrée caractéristiques
Création d’un vecteur d’entrée (plusieurs méthodes)
Séquences spécifiques obligatoires autour le gène d’intérêt —> reconnues par BP clonase
Gateway cloning systeme base sur quoi?
Sur comment un phage intègre son ADN dans une bactérie
Que fait l’intégrase dans Gateway Cloning?
Coupe et recombine l’ADN avec des séquences spécifiques
(C’est une Sérine Recombinase —> Sérine impliquée dans la coupure d’ADN)
BP clonase
INT (integrase)
IHF (integrase host factor)
—> supporte confirmation nécessaire pour faire la rotation
—> attB et attP deviennent attL et attR
LR Clonase
INT (integrase)
IHF (integrase host factor)
Xis (excisionase)
—> supporte confirmation nécessaire pour faire la rotation de cette direction
—> attL et attR deviennent attB et attP
Gateway cloning, que contient le vecteur destination a l’endroit où le gène va être introduit?
un gène qui code pour une toxine de E. Coli (ccdB)
—> bactéries avec le vecteur donneur va mourir à cause de la toxine acquérie du vecteur destination
—> seulement les bactéries avec le vecteur d’expression vont survivre
Comment assurer que chaque côté du gene soit inclus dans le vecteur dans Gateway cloning
Avoir 2 sortes de attL & attR
Ou attB & attP
(1 & 2)
—> permet clonage directionnel
Méthode pour faire de la mutagenèse (2)
Mutation ciblée par PCR (Quikchange)
Mutation ciblée par PCR (NEB)
Mutation ciblée par PCR (Quikchange) étapes
Synthèse par PCR —> non méthylé
Mutation ciblée par PCR (NEB)
1 seule amorce pour substitution & insertion
2 amorces pour délétion
