Cours 6 Flashcards
Objectif de l’expression protéique
Produire une protéine fonctionnelle
Facteurs influençant le choix du système d’expression (protéine)
But expérimental
Rendement
Besoin de purification
Modification post-traductionnelles Difficulté expérimentale
Coût
Systèmes d’expression
Bactéries
Levure
C d’insectes
Systeme de reticulocytes (transcription/traduction in vitro) —> permet d’ajouter des facteurs supplémentaires (ex aa marques)
C de mammifère en culture
Animaux transgéniques
Choix de bactéries et levures bon pour:
pour produire de grandes quantités de protéines pour des expériences in vitro
(mesure d’activités, études de structure, interaction protéine- protéine, production d’antigènes, de ligands, etc.)
Choix de c de mammifères bon pour :
étudier la fonction cellulaire/biologique, les modifications post-traductionnelles/activation, les interactions protéine-protéine, la participation aux voies de signalisation
—> sont souvent complémentaires et permettent de valider les résultats obtenus, surtout lors d’études structure/fonction de la protéine.
Choix du vecteur dépend de:
de l’organisme dans lequel on voudra exprimer la protéine
—> La séquence promotrice permettant d’induire la transcription de l’ADN complémentaire inséré dans le vecteur en ARNs messagers est spécifique à l’organisme-hôte.
Phosphorylation dans la bactérie?
Faible quantité
—> lorsqu’une kinase est encodée dans le gene en question
2 points clés dans l’expression de protéines recombinantes dans les b
1) choix du vecteur d’expression
2) choix de la souche d’E. Coli
ARN Pol à utiliser avec vecteur pET-28a
Polymerase T7 —> production d’ ARN plus forte (plus de qte) : production de proteines + forte (+ de qte)
—> aussi largement contrôlable (important pour que E. Coli n’éjecte pas le plasmide)
—> peut aussi utiliser polymerase native de E. Coli
Contrôle de la transcription T7 est basée sur quel mode de régulation de gene?
Operon Lac
—> transcription réprimée par le represseur Lac codé dans le génome d’E. Coli (gene LacI)
Represseur constitutif - inhibé par composantes connues sous nom d’inducteurs (ex IPTG)
= transcription
Souche bactérienne DE3 (douche d’e coli)
Modifiées pour coder l’ARN Pol T7 sous le contrôle du promoteur de l’opérateur Lac (activation par IPTG qui inhibe le represseur Lac)
—> gêne codé dans le vecteur pET aussi sous le contrôle du promoteur T7
Promoteurs qui peuvent être utilisés pour contrôler l’expression des vecteurs
T7
T7lac
Lac
araBAD
Tet
Promoteur pBAD
Régulation
AraC interagit avec O2 et I1 pour former une boucle —> inhibition
En présence d’arabinose et AMPc (se lie au CAP)
—> arabinose se lie a AraC qui change de conformation et se lié à I1 et I2
—> transcription activée
Vecteur avec régulateur d’arabinose
pBAD-Vectors
C’est quoi la répression de glucose?
Quand on a besoin du complexe CAP-AMPc pour activer la transcription
—> présence de glucose = absence d’AMPc = moins de transcription
—> utilisé dans Lac et araBAD
Mécanisme de régulation de transcription Tet
Régulée par molécule tétracycline
—> utilise pour induire ou réprimer des gènes spécifiques chez les mammifères
TRE : faire de 7 tetO
tTA —> tetracycline-controlled transactivator
Doxycycline peut se lier à tTA et rtTA
rtTA —> reverse tTA
tetR —> represseur tet
VP16 —> protéine virale 16
Tet off : absence de VP16 —> tTA se lie a TRE et active transcription
Avec VP16 —> VP16 se lie a tTA et transcription est inactivée
Tet on:
Sans VP16 —> rtTA pas lié à TRE et pas de transcription
Avec VP16 —> rtTA se lie a VP16 qui se lie a TRE et transcription est induite
4 types de régulation de gènes
activation de transcription
1) positif inductible
2) negatif inductible
inhibition de transcription
3) positif repressible
4) negatif repressible
—> contrôle négatif : represseur attache inhibe
—> contrôle positif : activateur attache active
Modifications standard de Souches d’E. coli conçues pour l’expression des protéines
ompT, élimine une protéase de la membrane externe
Ion protease, élimine la protéase
hsdSB, pas de système de méthylation/restriction
dcm, pas de cytosines méthylées
Étapes générales pour la production de protéines
•Transformation d’ADN en e coli —> sélection de b avec plasmide recombine par antibiotique et culture liquide
• après avoir atteint la densité optique à 37 C étape d’induction de transcription de la protéine à une temp plus faible (stabilité protéique)
—> activation du gene
• tester durée de l’induction en prélèvement à plusieurs temps
Transcription et traduction im vitro permet quoi?
Transcription d’ARNm et production de protéines sans avoir besoin d’une c hôte
Transcription et traduction faites en combien d’étapes?
Première étape : transcription avec Pol T7 —> création d’ADNm à partir de ADNc dans le plasmide
Deuxième étape: traduction
—> lysat bactérien, ribosomes, dNTP et autres enzymes
—> permet introduction d’étiquetage spécifique sur un dNTP
Étiquettes et protéines de fusion sont utilisés pour quoi?
pour faciliter la purification/analyse des protéines
Exemples d’Etiquettes et protéines de fusion
Gluthatione-S- transferase (GST)
Poly-Histidine (6X)
Maltose Binding Protein (MBP)
Strep-tag II
Protéine fluorescente (GFP, YFP, RFP…)
Étiquette flag, Myc, etc…
Pourquoi est-ce qu’il faut tester le placement de l’étiquette ?
Pour s’assurer qu’elle n’interagît pas avec le repliement ou la fonction de la protéine
